本发明涉及细胞工程学技术领域，具体涉及一种细胞膜功能化修饰方法。

背景技术：

细胞膜是真核细胞的重要组成部分，它不但与细胞的分裂，增殖，迁移及坏死等息息相关，还在细胞与外部环境发生物质、能量交换中发挥重要作用。同时，细胞膜还能调节细胞-细胞相互作用，细胞-细胞通讯和细胞内信号传导途径。因此，对细胞膜进行功能化修饰，有利于促进基础细胞生物学研究，调控细胞间相互作用，操纵细胞信号转导等。目前，已有大量的功能材料被修饰到细胞膜上，如dna，多肽，高分子材料等。在这些材料中，dna因其易于合成，结构可预测，可编程性强等优点而被广泛应用。目前常用的细胞膜修饰方法有：1.基于基因工程的方法。该方法通过向细胞内导入新的基因，进而在细胞膜上持续表达功能蛋白，从而实现细胞膜的功能化修饰。然而，这种方法不但操作复杂、耗时，而且可能会引起基因组成分的改变，给细胞研究带来不可预测的影响。2.基于静电吸附的方法。细胞的膜表面带负电荷，它可以通过静电作用吸附带正电的材料(如聚乙烯亚胺(pei)、多聚赖氨酸(pll)等)，实现细胞膜的快速修饰。然而，这些带正电的高分子聚合物通常具有较高的细胞毒性，而且其在细胞膜表面的稳定性受到培养基离子强度的影响(静电屏蔽作用)，限制了其实际应用范围。3.基于细胞代谢的方法。该方法利用人工合成的糖代谢前体将化学标签(如，叠氮基团)整合到细胞膜表面糖基化蛋白上。利用温和的点击化学反应，将带有炔基标记的探针修饰到细胞膜上。这种方法繁琐耗时，一般需要2-3天的代谢标记时间，难以实现细胞膜的快速修饰。4.基于共价交联的方法。细胞膜表面表达大量的蛋白质分子，这些蛋白质中含有大量的氨基，巯基等活性基团。通过氨基与琥珀酰亚胺酯(nhs)、巯基与马来酰亚胺酯(mal)等反应，将探针共价修饰到细胞膜表面。但该方法具有反应效率低，且涉及有机化学反应，可能产生较强的细胞毒性乃至影响细胞正常的生理功能。5.基于疏水端插入细胞膜的方法。磷脂双分子层是细胞膜的主要组成成分之一，其两端具有亲水性，而中间部分具有疏水性。两亲性探针可以利用其疏水端与磷脂双分子层之间的相似相溶性质，自发锚定到细胞表面上。此方法由于具有快速高效、普适性强、生物兼容性好等优点，受到了广泛关注。然而，目前通过这种方法修饰的探针在细胞膜上的稳定性较差，在复杂生物体系(如，含有血清的培养基)中容易从细胞膜表面脱落。此外修饰在膜表面的探针容易与其他成分发生非特异性相互作用，降低了探针的靶标识别能力。

技术实现要素：

本发明的目的是利用dna纳米技术，构建两亲性dna四面体探针，开发一种新型的细胞膜修饰方法。该方法不但能将探针分子快速、高效、无损地修饰到细胞膜上，还能显著提高探针在细胞膜上的稳定性及其分子识别性能。此外，基于dna纳米结构的可编程性，该方法可实现多种功能模块在细胞膜的高效自组装，为细胞分子生物学、组织工程及基于细胞的诊疗等领域的研究提供了新技术。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种细胞膜的功能化修饰方法，通过dna四面体上修饰的疏水分子的疏水作用将其插入到细胞膜磷脂双分子层，从而实现四面体在细胞膜表面的锚定，在dna四面体没有修饰疏水分子的顶点延伸出dna序列，或者通过延伸出的dna序列与其它功能单元结合完成细胞膜的功能化修饰。

所述的细胞膜的功能化修饰方法，dna四面体探针具有四个顶点，其中三个顶点均修饰有疏水分子。

所述的细胞膜的功能化修饰方法，疏水分子包括：胆固醇、二酰基脂质体或生育酚等。

本发明在dna四面体没有修饰疏水分子的顶点延伸出dna序列，可以用于细胞膜上分子特异性识别。

所述的细胞膜的功能化修饰方法，其他功能单元包括：核酸分子，核酸适配体、脱氧核酶、小分子、多肽、蛋白或纳米颗粒等。小分子包括：药物类小分子或发光基团小分子等，药物类小分子包括ce6等。纳米颗粒包括：金纳米颗粒，磁纳米颗粒等。

本发明还可以通过延伸出的dna序列与其它功能单元结合，实现各种功能。

比如：

功能单元为核酸适配体，其与dna四面体延伸出的dna序列互补杂交，可以实现细胞膜特异性识别及细胞间选择性团聚。

功能单元为药物小分子，与dna四面体延伸出的dna共价交联，可以实现治疗等功能。

功能单元为发光基团小分子，与dna四面体延伸出的dna共价交联，可以实现成像等功能。

所述的细胞膜的功能化修饰方法，合成四面体所需的四条dna链，其中s1,s2,s3均被胆固醇(cholesterol)修饰；

s1-cho:

tatcaccaggcagttgacagtgtagcaagctgtaatagatgcgagggtccaatactt-cholesterol,如seqidno.1所示。

s2-cho:

tcaactgcctggtgataaaacgacactacgtgggaatctactatggcggctcttctt-cholesterol,如seqidno.2所示。

s3-cho:

ttcagacttaggaatgtgcttcccacgtagtgtcgtttgtattggaccctcgcattt-cholesterol,如seqidno.3所示。

s4:

cccaggttctctttttttttacattcctaagtctgaaacattacagcttgctacacgagaagagccgccatagta；如seqidno.4所示，下划线的碱基为延伸序列。

所述的细胞膜的功能化修饰方法，

probesgc8探针(即一种核酸分子，能特异性识别并结合表达在细胞表面的ptk7蛋白，进而与高表达这种蛋白的细胞进行特异性结合)与s4中下划线碱基所示序列(即延伸dna序列)互补；probesgc8探针序列为：

aaaagagaacctgggttttatctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttaga，如seqidno.5所示。

上述序列仅仅为一个具体的优选例子，本发明方法中涉及的dna四面体序列不限于上述具体的序列，只要四条序列之间满足形成dna四面体结构，而且三个顶点均被疏水分子修饰即可。

本发明延伸出的dna和与之相连的构成四面体的序列之间设置5-8个随机碱基序列(满足不影响四面体正常形成的碱基，不影响探针识别功能即可，如5-8个t或a等)更有利于延伸出的dna特异性识别或者结合其他功能单元。

荧光基团修饰碱基的位置只要不影响四面体以及延伸序列的功能即可。

所述的细胞膜的功能化修饰方法，合成的四面体探针与细胞膜结合时体系中浓度达到优选250nm。

所述的细胞膜的功能化修饰方法，合成的四面体探针与细胞膜结合反应时间优选10分钟。

本发明技术方案的详细阐述：

1)两亲性dna四面体探针的制备

该dna四面体探针具有四个顶点。其中三个顶点分别修饰一个疏水分子(例如，胆固醇分子)，这些疏水分子可通过疏水作用插入到细胞膜磷脂双分子层，从而实现四面体探针在细胞膜表面的锚定。用第四个顶点延伸出一段特定的dna单链序列，利用这段dna序列或者通过dna互补杂交引入其他功能单元(例如，核酸适配体、脱氧核酶、小分子、多肽、蛋白等)，可用于实现细胞膜表面的分子识别或生物催化或治疗或成像等功能。四面体经过三个顶点的疏水性处理能够大大增加其在细胞膜表面的结合和稳定性，而且四面体具有良好的刚性及明确的三维结构，有利于探针分子远离细胞膜表面并保持有序的空间定向，从而增加探针的靶标识别能力。同时，探针分子模块选择的多样性使得该方法易于制备一系列具有特定功能的膜锚定探针。

两亲性四面体探针的制备流程如下：将合成四面体所需的四条dna链

s1-cho:tatcaccaggcagttgacagtgtagcaagctgtaatagatgcgagggtccaatactt-cholesterol,

s2-cho:tcaactgcctggtgataaaacgacactacgtgggaatctactatggcggctcttctt-cholesterol,

s3-cho:ttcagacttaggaatgtgcttcccacgtagtgtcgtttgtattggaccctcgcattt-cholesterol,

s4：

cccaggttctctttttttttacattcctaagtctgaaacattacagcttgctacacgagaagagccgccatagta。

上述s4序列中斜体显示的7个t即延伸出的dna和与之相连的构成四面体的序列之间设置的随机碱基序列。

将上述序列溶解到pbs缓冲液中(ph＝7.4，镁离子浓度为5mm)，使所有dna链条的最终浓度均为2μm，然后将该混合溶液在95℃下加热3分钟，缓慢降至室温，从而制备获得两亲性dna四面体探针t-cho3，如果s4的7个t的随机碱基序列中的粗体的碱基t进行荧光基团的修饰，则获得t-cho3-fam(用于本发明实施例中的t-cho3-fam制备)。

由s1-cho,s2-cho,s3-cho,s4及probesgc8可制得探针t-cho3-sgc8；

probesgc8序列为：(制备时体系中的浓度2μm)

aaaagagaacctgggttttatctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttaga。

由单个胆固醇修饰的单链dna分子s-cho1与probesgc8可制得探针s-cho1-sgc8；

s-cho1序列为：cccaggttctcttttttttttttttttt-cholesterol，如seqidno.6所示。

2)表征两亲性四面体探针

2.1)聚丙烯酰胺凝胶电泳表征两亲性四面体探针

用5％聚丙烯酰胺凝胶电泳表征所制备的探针t-cho3。取10μl样品，加入2μl甘油并充分混合。将混合液加入到5％的聚丙烯酰胺凝胶中，并在110v电压下进行45分钟电泳实验。实验结束后，用stainsall染料对聚丙烯酰胺凝胶染色15分钟，然后用水清洗两次，并用凝胶成像仪对样品成像。如图1所示，s1-cho,s2-cho,s3-cho和s4反应后很好的形成了探针t-cho3(泳道7)。

2.2)原子力显微镜成像表征两亲性四面体探针

取15μl制备的t-cho3探针，加入5μl浓度为300μm的氯化镍，在室温下混合5分钟。将混合液滴到云母片，并静置十分钟。用蒸馏水将云母片表面清洗三次，并在氮气氛围中进行干燥。干燥后的样品在原子力显微镜下进行成像。如图2所示，原子力成像表明合成的t-cho3探针呈均匀，单分散的颗粒状，其大小为10纳米左右。

3)胆固醇修饰数目对四面体探针在细胞膜上稳定性的影响

细胞计数后，取30万个cem细胞，pbs洗涤一次，并均分为3组，然后分别与250nm的t-cho1-fam(dna序列为与t-cho3-fam相同的四面体，但只修饰一个胆固醇)，250nm的t-cho2-fam(dna序列为与t-cho3-fam相同的四面体，但只修饰两个胆固醇)和250nm的本发明方法制备的t-cho3-fam在4℃下共孵育10分钟，pbs洗涤一次，分散到含有10％fbs的1640培养基中。三组细胞均在37℃，5％二氧化碳环境下分别培养0小时，0.5小时，1小时，1.5小时，pbs洗涤一次，共聚焦成像观察探针脱落情况。如图3所示，探针t-cho1-fam锚定效率低，且脱落速度快，在半小时内几乎全部脱落。t-cho2-fam相较于t-cho1-fam锚定效率提升，脱落速度减慢，但仍远低于t-cho3-fam。

4)t-cho3-fam两亲性四面体探针膜锚定条件优化：

4.1)膜锚定浓度优化

细胞计数后，取60万个cem细胞(人急性淋巴细胞白血病t淋巴细胞)，pbs洗涤一次，并均分为6组，然后分别与15.6nm,31.2nm,62.5nm,125nm,250nm,500nm的t-cho3-fam探针在4℃下共孵育10分钟，pbs洗涤一次，流式细胞仪检测。如图4所示，随着探针浓度的增加，荧光位移明显增加，当探针浓度达到250nm时，探针基本饱和。表明了两亲性四面体探针的高效膜锚定能力。

4.2)膜锚定时间优化

细胞计数后，取60万个cem细胞，pbs洗涤一次，并均分为6组，然后分别与250nm的t-cho3-fam在4℃下共孵育1分钟，2分钟，5分钟，10分钟，20分钟，30分钟，pbs洗涤一次，流式细胞仪检测。如图5所示，荧光位移值随孵育时间增加而增加，到10分钟基本饱和。表明了两亲性四面体探针能快速锚定到细胞膜。

本发明的有益效果

本发明通过制备两亲性dna四面体探针，发展了一种新型的细胞膜修饰方法。与传统的细胞膜修饰方法(如基于基因工程的方法，基于共价交联的方法及基于细胞糖代谢的方法)相比，该方法能实现快速高效的细胞膜修饰。其修饰时间缩短到10分钟，修饰所需的探针浓度也低至250nm。与常规的两亲性探针(如胆固醇修饰的单链dna探针)相比，两亲性dna四面体探针具有更高的膜稳定性(脱落速度大大降低，内吞效率也明显降低)。同时，dna四面体探针在细胞膜上的靶标识别能力也相较于常规的两亲性探针提升3倍。

附图说明

图1为聚丙烯酰胺凝胶电泳表征探针的形成。条带1：s1，条带2：s1+s2,条带3:s1+s2+s3,条带4:s1+s2+s3+s4,条带5：s-cho1+s2+s3+s4,条带6：s-cho1+s-cho2+s3+s4,条带7：s-cho1+s-cho2+s-cho3+s4(t-cho3)。

图2为原子力显微镜成像表征本发明两亲性dna四面体探针的形成；

图中比例尺代表100nm。

图3为胆固醇修饰数目对四面体探针在细胞膜上稳定性的影响；

(a)为共聚焦表征三种探针膜脱落速度，图中比例尺代表10μm；

(b)为荧光统计表征三种探针脱落速度。

图4为流式优化探针膜锚定浓度。

图5为流式优化探针膜锚定时间。

图6(a)为共聚焦表征两种探针膜脱落速度，图中比例尺代表10μm；

(b)为荧光统计表征两种探针脱落速度。

图7(a)为共聚焦表征两种探针的内吞效率，箭头指示了内吞进入细胞的探针，图中比例尺代表10μm；

(b)为荧光统计表征两种探针的内吞效率。

图8(a)为细胞聚集效率的统计，

(b)为romos细胞膜表面上单条sgc8探针引起的细胞聚集起始速度。

具体实施方式

以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1：本发明两亲性四面体探针在细胞膜上的稳定性

两亲性四面体探针降低的脱落速度

细胞计数后，取20万个cem细胞，pbs洗涤一次，并均分为2组，然后分别与250nm的s-cho1-fam(序列为：cccaggttctctt-/i6famdt/-tttttttttttttt-cholesterol,i6famdt代表该处的碱基t被荧光基团修饰)和250nm的本发明方法制备的t-cho3-fam在4℃下共孵育10分钟，pbs洗涤一次，分散到含有10％fbs的1640培养基中。两组细胞均在37℃，5％二氧化碳环境下分别培养0小时，0.5小时，1小时，1.5小时，pbs洗涤一次，共聚焦成像观察探针脱落情况。如图6所示，探针s-cho1-fam在半小时内几乎全部脱落，而探针t-cho3-fam即使在1.5小时，也只有不到20％的脱落。揭示了本发明使用的两亲性四面体探针相对于传统两亲性探针大大提高了在细胞膜上的稳定性。

实施例2：本发明两亲性四面体探针降低的内吞效率

细胞计数后，取20万个cem细胞，pbs洗涤一次，并均分为2组，然后分别与250nm的s-cho1-fam和250nm的t-cho3-fam在4℃下共孵育10分钟，pbs洗涤一次，分散到含有5mm氯化镁的pbs中。两组细胞均在37℃下培养15分钟，共聚焦成像观察探针内吞情况。如图7所示，探针s-cho1-fam在培养15分钟后，发生了明显的内吞，而探针t-cho3-fam无明显内吞。揭示了两亲性四面体探针相对于传统两亲性探针的大大提高了在细胞膜上的稳定性。

实施例3：本发明两亲性四面体探针在细胞膜上提升靶标识别能力

细胞计数后，取20万个ramos细胞，用红色活细胞示踪剂(celltrackertm)在37℃下染色15分钟,pbs洗涤一次，并均分为2组。然后分别与250nm的t-cho3-sgc8探针和250nm的s-cho1-sgc8探针在4℃下共孵育10分钟，pbs洗涤一次，分散到含有2％牛血清白蛋白(bsa)的dpbs中。再取200万个cem细胞，均分为两组，分别加到上述两组ramos细胞中，并在室温下摇晃(240rpm)10分钟，20分钟，30分钟，60分钟，90分钟，120分钟，240分钟，360分钟，540分钟。用共聚焦显微镜对不同时间点的样品进行成像，统计细胞图团聚效率。如图8所示，t-cho3-sgc8探针修饰的ramos细胞能够快速识别cem细胞，并引起高效的细胞团聚(60分钟后，聚集效率超过了85％)。同时，这种细胞聚集状态有较高的稳定性，即使720分钟后，细胞聚集效率仍高达60％。然而，s-cho1-sgc8探针修饰的ramos细胞对cem细胞的识别能力较差，在30分钟时，细胞的聚集效率达到最高峰值(仅约为25％)，随后快速下降，说明了在s-cho1-sgc8探针体系中，细胞聚集状态的稳定性较差。通过计算romos细胞膜表面上单条sgc8探针引起的细胞聚集起始速度，可以得出t-cho3-sgc8的分子识别能力要明显高于s-cho1-sgc8探针3倍。

序列表

湖南大学

一种细胞膜的功能化修饰方法

6

siposequencelisting1.0

1

57

dna

未知(unknown)

1

tatcaccaggcagttgacagtgtagcaagctgtaatagatgcgagggtccaatactt57

2

57

dna

未知(unknown)

2

tcaactgcctggtgataaaacgacactacgtgggaatctactatggcggctcttctt57

3

57

dna

未知(unknown)

3

ttcagacttaggaatgtgcttcccacgtagtgtcgtttgtattggaccctcgcattt57

4

75

dna

未知(unknown)

4

cccaggttctctttttttttacattcctaagtctgaaacattacagcttgctacacgaga60

agagccgccatagta75

5

60

dna

未知(unknown)

5

aaaagagaacctgggttttatctaactgctgcgccgccgggaaaatactgtacggttaga60

6

28

dna

未知(unknown)

6

cccaggttctcttttttttttttttttt28