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论文ID

原名：Forecasting the dissemination of antibiotic resistance genes across bacterial genomes 

译名：预测抗生素抗性基因在细菌基因组中的传播

期刊：Nature Communications

IF：14.919

发表时间：2021.4.23

通讯作者：Mostafa M. H. Ellabaan & Morten O. A. Sommer

通讯作者单位：丹麦技术大学诺和诺德基金会生物可持续研究中心

DOI号：10.1038/s41467-021-22757-1

实验设计

结果

为了确定可能的水平转移ARGs，我们使用了一个基于假设的统计检验，即在两个生物体之间水平转移的基因明显比它们的16S rRNA基因更保守。如果抗性基因的配对比较距离明显短于宿主16S rRNA基因，注释的ARGs被认为是可以水平转移的。作者将通过特定ARG统计检验的生物体组称为基因交换网络（GEN）（图1a）。作者还开发了一个包含1799个基因的统计基因转移的渠道，这是一个全面的、手工整理的ARG数据库。为了减少分析中的冗余，抗性基因被聚在95%的相似性和覆盖率。利用BLAST对56 716个基因组进行抗性基因库查询。作者识别了152个ARGs，这些ARGs很有可能被水平转移（图1b）。每个预测的ARG由至少两个物种共享，合并的GENs共包含895个细菌物种。按照参与GEN的属数进行排列，传播最广泛的基因包括临床相关基因，这些基因对β-内酰胺类、磺胺类、氨基糖苷类和四环素类抗生素具有耐药性（图1b和表1）。

作者在22 963个细菌基因组中观察到可转移的ARGs，它们代表了7个门，占数据库中基因组约40%（图1c）。这些基因组中含有四个抗性基因的中位值，这些抗性基因很有可能被水平转移（图1d）。所确定的GENs经常跨越不同的系统发育阶段，GENs中约52%的物种属于单一门，约48%的物种来自两个或两个以上的门类，突出表明跨门ARG传播是普遍的（图1c，e，f）。值得注意的是，GENs中约38%包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，突出了ARG通过生理分裂转移的潜力（图1c）。变形菌门与肠杆菌科中参与抗性基因交换最频繁的属高度相关。

表1. 基于包含高度传播基因的属的数量。

MGEs可以转移ARGs。利用MGEs的遗传标记，如转座酶、整合酶和其他重组酶，作者在ARGs的邻近遗传区域确定了可能的MGEs。作者排除了质粒和噬菌体基因，这些基因可能参与质粒或噬菌体的功能，但不直接促进含有ARGs的DNA片段的移动。排除这些基因的主要原因是在基因水平上很难识别噬菌体和质粒。噬菌体和质粒的构建和功能可能涉及多种遗传因素。随机的细菌基因组动力学可以让这些元素接近ARGs。然而，这些基因不会将ARGs从基因组捕获到质粒或噬菌体。只有MGEs，如插入元件，转座酶，或其他移动基因将ARGs从基因组转移到噬菌体或质粒。作者采取了这种非常保守的方法来避免假阳性。作者认为生成MGEs的库是一个小但高可信度的样本。

为了识别水平转移的MGEs，作者利用与可转移ARGs相关的1182 MGEs作为查询数据库的GEN途径（图2a）。只有274个MGEs以高可信度被预测为跨物种转移，强调了作者统计框架下的保守假设。因此，大多数MGEs可能有一个狭窄的物种内宿主范围，不能使用作者的方法解决或没有在作者的基因组数据集充分捕获。在22 595个基因组中发现了与ARGs相关的可转移MGEs，占基因组数据的39.8%。

转移的MGEs在三个细菌科的中位分布（图2b）。MGEs的系统发育范围各不相同，约12%的MGEs属于一个特定的属，约21%的MGEs能够在不同的门之间移动（图2c）。一些MGEs如IS1和IS240能够跨越革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌之间的屏障。其他MGEs，如属于IS166的MGEs，可能局限在棒状杆菌属（Corynebacterium）。含MGEs最多的门为变形菌门（图2d）。临床相关的具有不同MGEs的细菌科有肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、肠球菌科（Enterococcaceae）、葡萄球菌科（Staphylococcaceae）和莫拉菌科（Moraxellaceae）（表2）。MGEs的丰度与转移的ARGs的丰度密切相关（图2e）。

基于不同的与MGEs相关的ARGs的数量，对可转移的MGEs进行排序，显示IS1、IS240和Tn3科的MGEs具有高多样性，其中IS240科系统发育范围最广（图2f）。与氨基糖苷类、四环素或β-内酰胺类抗生素耐药相关的基因具有最多的独特的MGEs，这解释了这些ARGs的广泛传播（图2g）。

图2. 基因交换网络（GENs）中的可移动遗传元件（MGEs）。a 展示如何从ARG邻近区域提取移动遗传元素，使用Pfam注释，并确定MGE基因交换网络的概念性指南。b基于参与传播的系统发育科的MGEs分布。方框，系统发育科数目的范围；线和数，中位数；点，离群值。c MGEs的系统发育限制分布。局限于某种系统发育分类的MGEs的百分数。d在指示门中观察到的总MGEs的百分比。e ARG GEN大小（如属数）与相关MGE GEN大小的分布。f MGEs在微生物门的传播及其与附近观察到的可转移ARGs的关联。g根据产生耐药性的抗生素类别，与ARGs相关的MGEs的百分比。

表2. 可转移MGEs最多的菌科。

当比较ARGs的GENs和与ARG相关的MGEs的GENs时，作者发现MGEs的网络比与它们相关的ARGs更大（图3a，b）。作者假设MGEs的当前传播可以用来预测邻近可转移ARGs的潜在传播。由MGE动员的ARG的移动目前可能不会在所有携带MGE的物种中观察到（图3a，b）。因此，ARG的传播潜力可预计包括附近已观察到的移动元件的物种。为了评估目前已知ARGs的传播潜力，作者鉴定了存在MGE但未观察到邻近可转移ARGs的基因组。

基于这一分析，101个（约66%）可转移ARGs具有转移到一个新宿主的潜力（图3c）。根据其现有的MGE谱，共有463种未观察到可转移ARG的物种有可能获得可转移ARGs（图3b）。平均每个ARG可能转移到额外的164种，44属和21科，表明可转移耐药组仍有很大的传播潜力。在门水平上，预计84个可转移ARGs（>55%的可转移耐药组）能够转移到一个新的门。放线菌门（Actinobacteria）、蓝藻门（Cyanobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）可能是ARGs未来最主要的受体。另外，还有52个可转移ARGs还未在放线菌门中观察到，但在这个门中观察到邻近的MGEs。

具有高传播潜力的ARG的一个例子是ctx-m-125（图3d）。其目前的GEN有3个科（Yersinaceae、Enterobacteriaceae和Morganellaceae），并发现与4个可转移的MGEs相关：IS1、IS240、Tn3和IS110。这些MGEs目前在195个新种中发现，代表31个革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌科，使ctx-m-125具有广泛的传播潜力（图3d）。在Pseudomonadaceae中未发现ctx-m-125，但在Pseudomonadaceae中发现了3个与ctx-m-125相邻的MGEs（IS1、IS240和Tn3）。因此，除非功能或生态因素限制ctx-m-125的迁移，否则ctx-m-125将来可能会被这三个MGEs传播到Pseudomonadaceae中。

ARG组中传播潜力最大的是β-内酰胺酶基因如ctx-m和oxa，四环素抗性基因如tetC，氨基糖苷抗性基因如aac（6）- Ia、aph（6）-Id和aadA，大环内酯类抗性基因如ermB和mphA。

作者对耐药基因未来传播的预测显示（图4），ARGs有可能会转移到重要致病科的新属，从而使这些科中目前未观察到的抗生素类产生耐药性。

4 在SRA中确认预测的传播

序列读取存档（SRA）是序列数据（包括许多原始宏基因组样本）的公共存储库。作者只考虑了SRA中细菌全基因组序列数据。作者从SRA中获得了472 798个基因组来测试预测的ARG传播，检测了预测转移到Enterobacteriaceae、Staphylococcaceae和Streptococcaceae的ARGs。之所以选择这三个科，是因为它们保存的数据和代表了超过50%的SRA细菌基因组（约887 000个基因组）。这些科包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，是取样最多的科，包括许多常见的人类细菌病原体。

作者搜索了SRA中每个科的所有序列reads，发现Staphylococcaceae中62 209个基因组，Streptococcaceae中96 376个基因组，Enterobacteriaceae中314 213个基因组。这些基因组数据集是我们原始基因组数据库中这些科的基因组数的8.4-32.9倍，几乎占SRA可用基因组总数的50%。

对ARGs未来传播的预测是基于ARGs及其相关MGEs的系统发育范围的差异，而确认分析是基于使用SRA基因组的独立数据集在预测的宿主中发现ARGs（图5a）。例如，在最初的GEN中，Staphylococcaceae和Enterobacteriaceae中未观察到ARGs catI和tetH。然而，它们的相邻MGEs IS1和IS240的GENs表明，Staphylococcaceae和Enterobacteriaceae是catI和tetH未来的宿主。对SRA基因组的分析发现，在组装的Staphylococcaceae和Enterobacteriaceae基因组上，MGEs IS1和IS240以及ARGs catI和tetH间的距离在10 kb以内（图5b，c）。这些观察结果证实了作者的预测，即ARGs邻近的MGEs可以携带这些基因转移到新的科。这一发现支持使用作者的方法来预测可转移ARGs的传播。

作者对传播风险的分析预测了36个ARGs转移到Streptococcaceae，23个ARGs转移到Enterobacteriaceae和35个ARGs转移到Staphylococcaceae。作者发现3个（约8%）、8个（约35%）和23个（约66%）ARGs已经分别转移到Streptococcaceae，Enterobacteriaceae和Staphylococcaceae（图5d）。传播到Enterobacteriaceae的主要基因具有对β-内酰胺类（blaZ）、大环内酯类（ermT）和氨基糖苷类（aac（6’）-Ie-aph（2’’）-Ia）的抗性（图5e）。在Staphylococcaceae中经常观察到的基因具有对氨基糖苷类（aph（6）-Id和aph（3’’）-Ib）和磺胺类（sul基因）的耐药性。在Streptococcaceae中经常观察到的基因具有对氨基糖苷类（ant（9）-Ia）、β-内酰胺类（blaZ）和大环内酯类（erm（33））的抗性（图5e）。在作者最初的分析中并没有在这些科中观察到任何ARGs（图1）。

图5. 计算确认分析。a 通过邻近的MGE和MGE基因，将来自GENs的ARGs连接到未来的宿主，并通过SRA基因组证实水平基因转移预测的概念性指南。箱子显示已确认的ARGs转移到预测的宿主。b示例:Enterobacteriaceae预测的tetH基因的计算确认。该基因在巴氏杆菌的IS240附近被观察到，IS240在Enterobacteriaceae的基因组GCF 000693615.1中观察到并在EnterobacteriaceaeNCBI SRA基因组SRR6983026中被证实。c例子:使用catI和IS1进行计算确认，在当前GEN中观察到Escherichia、IS1在Staphylococcaceae基因组GCF 000159555.1中发现，catI和IS1在Staphylococcaceae SRA基因组ERR212931中同时发现。d被证实为特定菌科的预测基因的百分比。e在大量基因组中观察到的指定科的前三个基因。

虽然与潜在的受体物种兼容的MGEs可能会将基因转移，但转移的ARG的抗性机制可能与新的宿主的生理不兼容。例如，我们对未来传播的预测仅仅基于ARG-MGE关联，这意味着涉及万古霉素耐药的基因可能到达Enterobacteriaceae的物种，如大肠杆菌（图3a）。然而，由于万古霉素对Enterobacteriaceae无效，万古霉素耐药基因转移到大肠杆菌等Enterobacteriaceae没有选择压力。其他基因，如氨基糖苷耐药基因，与广泛的宿主兼容，但可能尚未达到其全部传播潜力（图3a）。作者之前的研究表明，编码氨基糖苷耐药酶的基因与大肠杆菌宿主是兼容的，尽管没有相关基因组的报道。因为这些基因在与大肠杆菌密切相关的变形菌（Gammaproteobacteria）中发现，并且位于在宿主中检测到的移动背景中，作者预计这些基因最终会转移到大肠杆菌。

作者的分析预测了大量的基因可以转移到比目前观察到的更多的物种中（图3a）。特别有趣的是β-内酰胺酶，因为它们在临床上重要的Enterobacteriaceae中广泛传播。虽然作者的silico预测表明这些基因可以在革兰氏阳性菌中进一步传播（图3a），但β，内酰胺酶在这些细菌中很少检测到（图3a）。尽管β-内酰胺酶与广泛兼容的移动元件相关，但β-内酰胺酶在革兰氏阳性基因组中的代表性不足，表明功能限制限制了它们的传播。

为了验证这一假设，作者对84个ARGs在革兰氏阳性模型生物枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的功能进行了实验评估。结果表明，当转移到该属时，具有氨基糖苷类、甲氧苄氨嘧啶、氯霉素和大环内酯类抗生素耐药的ARGs最有可能发挥作用。然而，这些功能基因中的大多数尚未在芽孢杆菌物种中被鉴定出来，一些基因，如catI、tetC、ermA、mphA、aph（3’’）和ant（2’），可能基于它们的MGE关联而到达该属。大多数在大肠杆菌中具有功能且广泛存在于革兰氏阴性菌中的25种β-内酰胺酶中没有一种在枯草芽孢杆菌中具有抗性表型。这一结果表明，尽管β-内酰胺酶在革兰氏阴性菌中的移动不受限制，但它们面临着强大的系统发育障碍，限制了它们在革兰氏阳性菌中的传播。

讨论

本文确定了可能介导152个可转移ARGs移动的GENs和移动元件，其中许多与临床抗生素耐药性有关。MGEs的丰度与转移的ARGs的丰度密切相关（图2e）。在之前的一项研究中，对23 425个基因组中移动ARGs及其邻近的移动元件的分析发现，系统发育是形成抗性基因转移网络的另一个主要变量。本文发现与MGEs在形成ARGs在不同门的传播中的重要性是一致的。换句话说，ARGs在微生物群落中的传播受到其相关MGEs的限制。具有多种MGEs的生物可能更容易获得和转移ARGs。因此，作者基于ARGs相关MGEs的系统发育范围预测了ARGs的传播。这些预测通过一个独立的基因组数据库得到了部分验证。

分析表明101个ARGs可以通过与这些基因相关的MGEs进一步传播。本文发现几个可转移的ARGs与一个以上的MGE相关，这将增加传播的潜力。作者的预测没有考虑ARG与新宿主的功能兼容性。这是一个重要的限制，因为作者之前已经证明，在200个耐药基因中，有74个在大肠杆菌中没有产生耐药性。在这里，作者发现某些β-内酰胺酶根据其MGE网络预测可转移到革兰氏阳性宿主，但在革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌中不产生耐药性。尽管MGEs的系统发育存在重叠，但这一生理限制可能抑制了ARG的传播。尽管如此，约36%预测的新转移是在相同的细菌科中，使得具有功能性ARG表达成为可能。

尽管研究了大量的基因组，文中的基因组数据库只代表了全球细菌多样性的一小部分样本。此外，人类病原体在序列数据库中的比例过高限制了跨物种的广泛定量比较。未来，要全面了解抗性基因的传播，需要对微生物组进行系统、大规模的代表性采样，以揭示转移网络的完整程度，发现潜在的物种起源，并全面绘制可转移ARGs的未来潜在的传播途径。本研究开发的方法可以作为对抗生素耐药性传播具有高风险的ARGs进行排名的基础。这可以提供对ARG传播机制和障碍的基本了解，以指导预测和限制抗生素耐药性出现的研究工作。