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质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。

补水至50ul，37°C孵育3~4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。酶切后载体通过切胶回收线性化载体。

双酶切1和2，在设置酶切体系时要考虑酶切温度以及Activity in NEBbuffer的问题，可在NEB公司主页的Double Digest Finder里面进行查询。

2

根据目的序列构建引物后，如果目的基因片段只有几十kb的话，可以选择退火方式使插入片段成为互补序列。

（1）引物设计方法：举个栗子，比如选择的限制性内切酶为BglII与HindIII，则根据酶切位点序列在引物的两端加粘性末端碱基序列。

引物合成形式：5’-GATCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNTCGA-5’

（2）在PCR仪中按照以下touch down程序运行95°C, 5 min; 95–85°C at −2°C /s; 85–25°C at −0.1°C /s; hold at 4°C。

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线性化质粒载体与退火产物进行T4 DNA酶连接。

T4 DNA酶连接一般选择16℃过夜。

注：连接可以选择公式计算，一般按照最适克隆载体与插入片段摩尔比为1:2，即最适插入片段使用量为0.06 pmol。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：

最适克隆载体使用量= [0.02×克隆载体碱基对数]ng (0.03 pmol)

最适插入片段使用量= [0.04×插入片段碱基对数]ng (0.06 pmol)

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转化

将连接产物转化到受体菌中（一般为DH5a）,涂板,培养过夜。注意质粒的抗性，选择对应的平板。

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挑取单克隆,并鉴定

挑去平板上的单克隆培养,可以通过PCR或者酶切初步鉴定阳性克隆,对初步

鉴定出来的阳性克隆进行测序。

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