1.本发明涉及植物组织原生质体分离技术领域，涉及一种梨茎原生质体的分离方法，具体涉及梨组培苗茎原生质体的分离、提取及纯化方法。

背景技术：

2.梨(学名：pyrus l.)是蔷薇科梨属的植物，素有“百果之宗”之称，是世界性广泛栽培的重要果树，也是我国的第三大栽培果树。梨具有较高的经济价值和营养价值，深受生产者和消费者喜爱。梨是多年生的木本植物，具有自交不亲和性等特点，目前主要是以传统的杂交育种、实生和芽变选种等手段进行新品种的选育，耗时耗力。利用原生质体细胞融合技术，可以实现遗传重组，定向改良抗性性状和果实品质等性状，从而培育优良品种。可见，获得高质量的原生质体是开展无融合遗传重组的前体条件。此外，随着新技术的发展，单细胞测序逐渐成为研究的热点。单细胞测序是以单个细胞为单位进行dna或rna水平测序，能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性。单细胞测序工程需要的载体即为无细胞壁的原生质体结构以及更为纯净的原生质体承载环境。因此，如何制备高质量的原生质体是非常重要的基础性工作。3.植物原生质体是植物细胞除去细胞壁的、具有活性的细胞。已有研究表明不同植物的细胞壁特性不同，同一植物的不同组织、不同部位细胞壁特性也存在差异。植物的特殊结构——细胞壁是原生质体分离、提取的重大障碍。目前原生质制备中常用的有纤维素酶、离析酶、果胶酶，渗透压调节剂有甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮等。由于失去细胞壁的保护作用，原生质体机械强度丧失，易吸水涨破，继而维持原生质体完整形态及保持原生质体活性的条件十分苛刻。4.梨叶片的原生质体分离和提取已有专利报道《一种梨叶原生质体的提取方法》，但是使用其方法制备梨茎的原生质体不仅耗时长，并且获得的原生质体数量无法达到单细胞测序的要求，而且其使用的清洗液中包含ca2+离子不可满足上机条件。其可能的原因是叶片和茎是完全不同的组织，两者在细胞壁组分(纤维素、木质素)、含量、及细胞渗透压等方面存在较大差异，因此需要摸索和提出适宜梨茎原生质体分离的技术体系。

技术实现要素：

5.本发明的目的：提供一种梨组培苗茎的原生质体制备方法，高效获得大量、无杂质污染的原生质体。6.为了实现上述目的，本发明具体技术方案如下：7.一种梨茎原生质体的分离方法，包含以下步骤：8.(1)取梨组培苗茎段，用手术刀片切成0.5-1.0mm茎段；9.(2)将处理好的组织材料放入含有酶解液的锥形瓶中，酶解液组成为0.5-0.8m甘露醇、10-12mm mes(ph 5.8)、2.0-3.0％纤维素酶rs、1.0-1.5％离析酶r10、0.5-1.2％牛血清蛋白、0.8-1.4mm cacl2；10.(3)将装有组织材料的锥形瓶抽真空维持0.05-0.07mpa的压强25-30min，置于30-50rpm摇床上振荡酶解；11.(4)用40-50um细胞筛过滤酶解液，回收组织残渣；12.(5)向上述组织残渣中加入少量wi释放液，轻轻晃动，用40-50um细胞筛过滤组织残渣沉淀，至新的50ml离心管中，离心；所述的wi释放液组成为:0.5-1.8m甘露醇、3-5mm mes(ph 5.8)、4-5mm kcl；13.(6)将步骤(5)离心所得上清重新加入至组织残渣中，重复步骤(5)3-5次；14.(7)去除上清，剩余1-2ml释放液，轻轻吸打混匀沉淀；15.(8)蔗糖界面离心纯化：在15ml离心管中加入15-25％的蔗糖溶液6-8ml，将上述含沉淀的溶液轻轻铺放至蔗糖溶液以上，离心，上清即为原生质体，吸入新的离心管备用。16.作为本发明的一种优选，步骤(2)中所述的组织材料与酶解液的质量体积比为：1:7～15(g/ml)，优选1:5(g/ml)。17.作为本发明的一种优选，步骤(2)中所述酶解液组成为0.7m甘露醇、10mm mes(ph 5.8)、2.4％纤维素酶rs、1.2％离析酶r10、1％牛血清蛋白、1mm cacl2。18.作为本发明的一种优选，步骤(3)中真空维持0.06mpa的压强30min，置于40rpm摇床上酶解3-5h。19.作为本发明的一种优选，步骤(4)中所述使用的细胞筛为40um。20.作为本发明的一种优选，步骤(5)中所述的wi释放液组成为:0.7m甘露醇、4mm mes(ph 5.8)、4mm kcl。21.作为本发明的一种优选，步骤(5)中所述离心转速为4℃、300rcf，离心时间为5min。22.作为本发明的一种优选，步骤(8)中所述进行界面离心所用蔗糖为20％。23.作为本发明的一种优选，步骤(8)中所述离心条件为4℃、300rcf，离心5min。24.使用台盼蓝染色对本发明制备的原生质体细胞进行活性检测：将4％的台盼蓝用10×pbs稀释至0.4％备用；原生质体悬浮液与0.4％台盼蓝染液按9:1混合混匀(台盼蓝工作液浓度0.04％)；2-3min反应后在镜下观察细胞状态。25.本发明采用以上技术方案制备梨组培苗茎的原生质体，有以下优点：26.(1)通过将步骤(5)离心所得上清重新加入至组织残渣中，重复步骤(5)3-5次，可以获得大量梨组培苗茎的原生质体，(2)本发明中的wi释放液保证了原生质体的完整性和活性，wi释放液组成简单，能满足单细胞测序要求。(3)蔗糖界面离心法有效的去除破碎细胞以及微小杂质，保证了原生质体的纯度，获得背景干净的原生质体，对梨遗传重组、体细胞杂交，单细胞测序等具有重大意义。附图说明27.图1秋子梨组培苗28.图2秋子梨组培苗预处理29.图3裂解前示意图30.图4滤液离心后沉淀镜检结果31.图5 wi溶液释放一次后沉淀镜检结果32.图6 wi溶液释放三次后沉淀镜检结果33.图7蔗糖界面纯化前34.图8蔗糖界面纯化后35.图9蔗糖界面纯化镜检结果具体实施方式36.为了更准确的描述本发明，通过以下实施案例对本发明进行说明。37.本发明所用母液和工作液配比见下表：38.表1:母液及其配制[0039][0040]表2:酶解液及其配制[0041][0042]表3:wi释放液及其配制[0043][0044]实施例1[0045]一种梨茎原生质体的分离方法，包含以下步骤：[0046]说明：所有镜检均为离心后去除上清(留500ul溶液)后，混匀沉淀后镜下观察。[0047](1)材料准备[0048]将秋子梨组培苗继代至增殖ms培养基上，16h光照/8h黑暗，25℃下培养30d(图1)，取25棵组培苗的茎(图2)，手术刀片切为0.5-1.0mm茎段；[0049](2)酶解液裂解[0050]将配制好的10ml酶解液至于50ml锥形瓶中，加入准备好的茎段2g(图3)；[0051](3)在0.06mpa的压强下维持30min，置于摇床中25℃，40rpm震荡3.5h；[0052](4)释放[0053]酶解液(以下步骤均放置冰上进行)用40um细胞筛过滤至50ml离心管中，保留植物组织残渣；滤液为第一次酶解释放的原生质体(原生质体含量少、杂质多(图4滤液在4℃、300rcf，离心5min，留底部溶液500ul混匀后镜检)，弃去不用；[0054](5)向组织残渣中缓慢加入10ml wi释放液轻轻晃动1min，用40um细胞筛过滤至新的50ml离心管中，4℃、300rcf，离心5min，小心吸取上清(重新加入至组织残渣中)，留底部溶液(包含原生质体)500ul混匀后镜检(图5)；[0055](6)将上清重新加入至组织残渣中，用40um细胞筛过滤至同一离心管中，4℃、300rcf，离心5min，重复3次，小心吸取上清(弃掉)，留底部溶液(包含原生质体)500ul混匀后镜检(图6)；[0056](7)蔗糖界面离心纯化[0057]去除上清，剩余1-2ml释放液，与沉淀混匀；[0058](8)在15ml尖底离心管中加入6ml 20％蔗糖溶液，将含原生质体的释放液轻轻吸打至蔗糖溶液上(图7)，100rcf离心3min，上清即为原生质体悬浮液(图8)，吸入1.5ml离心管备用(图9)。[0059]原生质体活性的鉴定：[0060]使用台盼蓝染色对原生质体细胞进行活性检测：2ul原生质体悬浮液与18ul 0.4％台盼蓝染液混合混匀，反应3min后在镜下观察细胞状态。图4、图5、图6、图9均为染色后结果。