本发明属于微生物培养的技术领域，具体涉及一种厌氧菌的平板计数方法。

背景技术：

微生物的培养需要满足两个基本的条件：生长所需的营养物质及培养环境；营养物质主要包括培养基；培养环境主要包括培养温度、培养过程的氧气含量及培养基的ph。厌氧微生物没有完整的代谢酶系，故以无氧发酵的方式进行能量代谢，其生存需在较低的氧化还原电势条件下才能进行。

固体培养基表面生长的细菌，按其对氧的耐受程度的不同，可分为专性厌氧菌、微需氧厌氧菌和兼性厌氧菌。厌氧菌只能在低氧分压的条件下生长，而不能在空气(18％氧气)和(或)10％二氧化碳浓度下生长。

虽然目前培养厌氧菌的方法很多，其中应用较广泛且有成效的有：厌氧袋法、厌氧盒法、烛缸法、厌氧培养箱法及智能厌氧系统法等。以上几种检测方法，都存在各自的缺陷，或操作繁琐，或设备昂贵，或耗时耗材。正由于以上缺陷，设计一种价格低廉，方法简便，不需催化剂的厌氧菌培养方法就十分必要。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种厌氧菌的平板计数方法，克服现有技术中厌氧菌培养装置结构复杂，价格昂贵，需要额外添加脱氧剂或催化剂的问题。

为了达到上述的目的，本发明提供了一种厌氧菌的平板计数方法，包括以下步骤：

1)好氧菌菌悬液的制备：吸取好氧菌甘油管保藏菌液，以0.5～1.0％(v/v)的接种量接种于50ml的营养肉汤培养基，于培养温度30～40℃，转速100～200rpm/min的条件下培养20～30h后，取10ml菌液加入到无菌试管，于水浴条件下处理5～15min，之后于无菌条件下吸取1ml菌液，使用无菌生理盐水将菌液按体积稀释10～1000倍，得到好氧菌菌悬液，4℃保藏备用；

2)单层平板制备：于无菌条件下，将多个待测厌氧菌固体样品或发酵液样品，梯度稀释后，分别吸取1.0ml稀释液，加入到多个培养皿中，之后分别加入5～15ml的半固体琼脂培养基，将培养皿放置于水平桌面，室温下自然凝固后得到多个单层平板；

3)双层平板的制备和培养：无菌条件下，于步骤2)中制备的多个单层平板中分别加入5～15ml半固体琼脂培养基，放置于水平桌面，自然凝固后得到多个双层平板营养琼脂培养基，吸取0.1～1ml步骤1)中得到的好氧菌菌悬液，分别加入之前得到的多个双层平板营养琼脂培养基的表面，使用无菌涂布器涂布均匀，待表面无明显水渍，盖好培养皿皿盖，倒置于30-40℃的培养箱中培养；

4)观察与计数：待多个培养皿中出现肉眼可见的菌落后，取出培养皿进行计数。

进一步地，其中步骤1)中，所述好氧菌包括产芽孢好氧细菌。

进一步地，其中步骤1)中，所述好氧菌选自枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌中的至少一种。

进一步地，其中步骤1)中，所述水浴温度为80～90℃。

进一步地，其中步骤1)中，所述好氧菌菌悬液的制备具体包括：吸取好氧菌甘油管保藏菌液，以1.0％(v/v)的接种量接种于装有50ml的营养肉汤培养基的250ml摇瓶中，于培养温度35℃，转速180rpm/min的条件下培养30h后，取10ml菌液加入到无菌试管，85℃水浴条件下处理10min，之后吸取1ml菌液于无菌条件下使用无菌生理盐水将菌液按体积稀释100倍，得到好氧菌菌悬液，4℃保藏备用。

进一步地，其中步骤2)中，所述培养皿的皿底直径90mm，皿底高20mm；所述半固体琼脂培养基的加入量为15ml。

进一步地，其中步骤2)中，每个所述待测厌氧菌固体样品或发酵液样品选择三个稀释度，每一个稀释度设置三个平行计数平板。

进一步地，其中步骤3)中，所述双层平板的制备具体包括：无菌条件下，于步骤2)中制备的单层平板表面加入10ml半固体营养琼脂培养基，室温下，自然凝固后得到双层平板营养琼脂培养基，吸取0.1ml步骤1)中得到的好氧菌菌液，加入之前得到的双层平板营养琼脂培养基的表面，使用无菌涂布器涂布均匀，待表面无明显水渍，盖好培养皿皿盖，倒置于37℃培养箱中培养。

进一步地，其中步骤4)中，所述观察与计数具体包括：待多个培养皿的下层平板中出现肉眼可见的单菌落后，取出培养皿进行菌落计数。

进一步地，其中步骤4)中，每个培养皿的下层平板中的菌落数在30～300范围内，均为统计对象。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点：

本发明利用枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌芽孢，萌发时大量消耗氧的特性，降低密封环境中的氧气浓度，为厌氧菌的培养创造低氧或无氧条件，该方法与传统的厌氧袋法、厌氧盒法、烛缸法、厌氧培养箱法、智能厌氧系统法等方法相比，具有简单实用，成本低廉，无需特殊脱氧剂或特殊装置脱除氧等特点。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例进行说明。

以下各种材料或试剂，若非特别说明，均为市售。

实施例1

待测样品：100亿丁酸梭菌菌粉。

1)好氧菌菌悬液的制备：吸取枯草芽孢杆菌甘油管保藏菌液，以1.0％(v/v)接种量接种于50ml营养肉汤培养基，于培养温度35℃，转速180rpm/min的条件下培养30h后，取10ml菌液加入到无菌试管，于85℃的水浴条件下处理10min，之后于无菌条件下吸取1ml菌液，使用无菌生理盐水将菌液按体积稀释100倍，得到枯草芽孢杆菌芽孢悬液，4℃保藏备用；

2)单层平板制备：于无菌条件下，取10.0g待测菌粉加入到90ml生理盐水中，分别梯度稀释至10-7，10-8，10-9稀释度，分别吸取1.0ml稀释液，加入到皿底直径90mm，皿底高20mm的多个培养皿中，之后分别加入15ml融化的冷却至45～55℃的亚硫酸铁琼脂培养基，将该些培养皿放置于水平桌面，室温下自然凝固后备用，得到多个单层平板；

3)双层平板的制备：无菌条件下，于步骤2)中制备的多个单层平板中加入10ml半固体营养琼脂培养基，放置于水平桌面，室温下自然凝固后得到多个双层平板营养琼脂培养基，吸取0.1ml步骤1)中得到的枯草芽孢杆菌芽孢悬液，分别加入之前得到的多个双层平板营养琼脂培养基的表面，使用无菌用涂布器涂布均匀，待表面无明显水渍，盖好培养皿皿盖，倒置于37℃的培养箱中培养。

待测菌粉的每一个稀释度设置三个平行，同时设置对照组：对照组使用亚硫酸铁琼脂培养基作为计数培养基，计数平板倒置于厌氧袋中，加入商用的厌氧产气包，排出袋内空气，37℃培养。

培养完成后，实验组与对照组的每个培养皿下层平板中菌落数在30～300范围内，均为统计对象。

实验组与对照组的菌落计数结果对比如下表1所示。

表1

从表1的数据可以看出，与传统的检测方法(对照组)相比，实施例1所述的方法(实验组)标准差与误差更小，且该检测方法简单易行，成本更加低廉。

实施例2

待测样品：混合菌种微生态制剂，其中粪肠球菌20亿，枯草芽孢杆菌90亿。

1)好氧菌菌悬液的制备：吸取枯草芽孢杆菌甘油管保藏菌液，以0.5％(v/v)的接种量接种于50ml营养肉汤培养基，于培养温度37℃，转速150rpm/min的条件下培养24h后，取10ml菌液加入到无菌试管，于80℃水浴条件下处理15min，之后于于无菌条件下吸取1ml菌液,使用无菌生理盐水将菌液按体积稀释10倍，得到枯草芽孢杆菌芽孢悬液，4℃保藏备用；

2)单层平板制备：于无菌条件下，取10.0g待测菌粉加入到90ml生理盐水中，分别梯度稀释至10-6，10-7，10-8，每个稀释度吸取1.0ml稀释液，加入到皿底直径90mm，皿底高20mm的多个培养皿中，之后分别加入10ml融化后冷却至45～55℃的mrs琼脂培养基，将该些培养皿放置于水平桌面，室温下自然凝固后备用，得到多个单层平板，

3)双层平板的制备：无菌条件下，于步骤2)中制备的多个单层平板中加入10ml融化后冷却至45～55℃的营养琼脂培养基，放置于水平桌面，室温下自然凝固后得到多个双层平板营养琼脂培养基，吸取0.1ml步骤1)中制备的枯草芽孢杆菌芽孢悬液，分别加入之前得到的多个双层平板营养琼脂培养基的表面，使用无菌涂布器涂布均匀，待表面无明显水渍，盖好培养皿皿盖，倒置于37℃的培养箱中培养。

待测菌粉的每一个稀释度设置三个平行，同时设置对照组：对照组使用mrs+caco3琼脂培养基作为计数培养基，计数平板倒置于厌氧袋中，加入商用的厌氧产气包，排出袋内空气，37℃培养。

培养完成后，实验组与对照组的每个培养皿下层平板中菌落数在30～300范围内，均为统计对象。

实验组与对照组的菌落计数结果对比如下表2所示。

表2

从表2的数据可以看出，与传统检测方法(对照组)相比，实施例2所述的方法(实验组)标准差与误差更小，且该检测方法简单易行，成本更加低廉。

实施例3

待测样品：产气荚膜梭菌发酵液。

1)好氧菌菌悬液的制备：吸取地衣芽孢杆菌甘油管保藏菌液，以0.5％(v/v)的接种量接种于50ml营养肉汤培养基，于培养温度37℃，转速150rpm/min的条件下培养24h后，取10ml菌液加入到无菌试管，于90℃的水浴条件下处理5min，之后于无菌条件下吸取1ml菌液，使用无菌生理盐水将菌液按体积稀释10倍，得到地衣芽孢杆菌芽孢悬液，4℃保藏备用；

2)单层平板制备：于无菌条件下，取10ml待测产气荚膜梭菌发酵液，加入至90ml生理盐水中，分别梯度稀释至10-5，10-6，10-7三个稀释度，分别吸取1.0ml稀释液，加入到皿底直径90mm，皿底高20mm的多个培养皿中，之后分别加入15ml融化的冷却至45～55℃的rcm琼脂培养基，将该些培养皿放置于水平桌面，室温下自然凝固后备用，得到多个单层平板；

3)双层平板的制备：无菌条件下，于步骤2)中制备的多个单层平板中加入10ml融化的冷却至45～55℃的营养琼脂培养基，放置于水平桌面，室温下自然凝固后得到多个双层平板营养琼脂培养基，吸取0.1ml步骤1)中得到的地衣芽孢杆菌芽孢悬液，分别加入之前得到的多个双层平板营养琼脂培养基的表面，使用无菌涂布器涂布均匀，待表面无明显水渍，盖好培养皿皿盖，倒置于37℃的培养箱中培养。

待测产气荚膜梭菌发酵液的每个稀释度设置三个平行，同时设置对照：对照组使用rcm琼脂培养基作为计数培养基，计数平板倒置于厌氧袋中，加入商用的厌氧产气包，排出袋内空气，37℃培养。

培养完成后，实验组与对照组的每个培养皿下层平板中菌落数在30～300范围内，均为统计对象。

实验组与对照组的菌落计数结果对比如下表3所示。

表3

从表3的数据可以看出，与传统的检测方法(对照组)相比，实施例3所述的方法(实验组)标准差更小，且该检测方法简单易行，成本更加低廉。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。