1.本发明涉及文库构建技术领域，尤其涉及一种单细胞文库的构建方法。

背景技术：

2.单细胞测序及组学分析技术对阐明组织中复杂多样的细胞个体在发育和功能等方面的异质性具有重要作用。其中，单细胞rna测序可以提供单个细胞基因表达方面的信息；而单细胞atac测序通过捕获单个细胞的染色质开放状态，使得在单细胞水平分析表观遗传调控成为可能。3.基于微流控系统的油包水微液滴技术是实现单细胞测序的重要方法之一。微液滴包裹可以在物理层面实现单细胞分离；将单细胞与单个标记微珠共同包裹则可以实现对单细胞文库的标记；在微液滴中进行逆转录反应或扩增反应，是构建单细胞rna或dna文库的基础。4.然而在微流控过程中，比溶液密度大的标记微珠通常容易发生沉降，造成分布不均、局部堆积甚至管路堵塞等问题，进而导致多包和空包率异常升高，降低单细胞实验的通量、可信度和稳定性。5.已有的一些解决方法包括采用大尺寸定制微珠，其与微液滴相近的直径保证了它们在微液滴内的单一分布；但是这一尺寸要求也同时限制了微流控芯片、微珠及其偶联成分的选择范围，降低了系统自由度且不利于控制成本。还有一些其它物理方法，包括对微珠悬液施加磁力搅拌，或利用内径小、长度大的管路来装载悬液以维持微珠的分散状态。然而此类方法依然有操作复杂、可控性及自由度偏低、易损伤微珠等问题。6.因此，现有技术还有待于改进和发展。

技术实现要素：

7.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种单细胞文库的构建方法，旨在解决现有操作可控性及自由度偏低、易损伤微珠等问题。8.本发明的技术方案如下：9.一种单细胞文库的构建方法，其中，包括步骤：10.制备细胞悬液或细胞核悬液；11.将带有单细胞dna标记的微珠重悬在含有密度增加剂的缓冲液中，得到微珠悬液，将所述微珠悬液加入水平放置的储液池中，将所述储液池的入口端与含有驱动液的管路连接，将所述储液池的出口端与微液滴芯片连接；其中，所述密度增加剂用于增加所述缓冲液的密度，所述密度增加剂与所述缓冲液的质量体积比在20％‑70％之间；12.将所述细胞悬液或细胞核悬液加入上样管路中，将分离油加入分离油管路中，搭建好微流控系统；13.将所述储液池翻转至垂直位置，然后运行微流控系统并收集生成的油包水微液滴；14.对所述油包水微液滴进行紫外照射处理；15.通过pcr反应对紫外照射处理后的溶液进行扩增，然后使扩增处理后的溶液中的微液滴破裂，通过再次扩增和纯化得到单细胞文库。16.可选的，所述密度增加剂为蔗糖。17.可选的，所述密度增加剂为聚蔗糖或葡聚糖。18.可选地，所述含有密度增加剂的缓冲液中，所述密度增加剂与所述缓冲液的质量体积比在30％‑50％之间。19.可选地，所述储液池的内径为0.4‑4mm。20.可选的，所述储液池的长度可以为20‑400mm中的任意数值，具体长度则根据储液池的内径和微珠悬液的体积确定。21.可选地，所述储液池为pdms硅胶软管，或其它材料的惰性软管。22.可选地，所述驱动液为矿物油或植物油等非极性溶剂，其密度小于微珠悬液且不与其混溶。23.可选地，所述细胞悬液或所述细胞核悬液与所述微珠悬液的混合体积比为大于2：1且小于9:1的任意数值，使混合后所得水相溶液中密度增加剂的终浓度降低至10％以下。24.可选地，所述含有密度增加剂的缓冲液中，所述缓冲液为高保真pcr缓冲液，如kapa pcr缓冲液和q5 pcr缓冲液等中的一种。25.有益效果：本发明提供了一种单细胞文库的构建方法。所述方法采用高密度溶液作为带有单细胞dna标记的微珠(下称标记微珠)的悬浮液，采用具有一定高度的细长管路作为微珠悬液的储液池；所述高密度溶液极大地降低了大比重标记微珠在储液池中的沉降速率，达到了在微流控过程中维持标记微珠均匀分散的目的；在形成油包水微液滴过程中，所述高密度缓冲液以一定比例与细胞/细胞核悬液混合，其溶质被稀释至低浓度，使下游文库标记和扩增反应得以进行。本发明解决了单细胞标记微珠在微流控过程中易发生沉降，进而影响文库制备的问题；所述方案适用于一系列密度和尺寸的标记微珠，扩展了选择范围，包括价格较低、非商业化或自主设计的产品，进而降低了单细胞文库的制备成本。另外，所述储液池及连接方案结构简单、操作方便，可选择合适的容积而避免浪费；其易于更换的特性适合连续制备多个文库。附图说明26.图1为本发明微流控系统的结构示意图。27.图2为本发明实施例中提供的一种用于贮存微珠悬液的细长储液池的结构示意图。28.图3为本发明实施例中生成的油包水微液滴的图像。29.图4为本发明实施例中文库的插入片段的分布。30.图5为本发明实施例中单细胞文库的frip(位于峰区的序列段占比)分布。31.图6为本发明实施例中单细胞文库的有效数据量和tss enrichment(转录起始点富集)值的分布。32.图7为本发明实施例中添加有不同浓度蔗糖的文库扩增反应的扩增曲线图和产物分布图。具体实施方式33.本发明提供一种单细胞文库的构建方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。34.本发明实施例提供一种单细胞文库的构建方法，其中，包括步骤：35.制备细胞悬液或细胞核悬液；36.将带有单细胞dna标记的微珠重悬在含有密度增加剂的缓冲液中，得到微珠悬液，将所述微珠悬液加入水平放置的储液池中，将所述储液池的入口端与含有驱动液的管路连接，将所述储液池的出口端与微液滴芯片连接；其中，所述密度增加剂用于增加所述缓冲液的密度，所述密度增加剂与所述缓冲液的质量体积比在20％‑70％之间；37.将所述细胞悬液或细胞核悬液加入上样管路中，将分离油加入分离油管路中，搭建好微流控系统；38.将所述储液池翻转至垂直位置，然后运行微流控系统(如图1所示)并收集生成的油包水微液滴；39.对所述油包水微液滴进行紫外照射处理(目的是释放单细胞dna标记)；40.通过pcr反应对紫外照射处理后的溶液进行扩增，然后使扩增处理后的溶液中的微液滴破裂，通过再次扩增和纯化得到单细胞文库。41.本实施例改进之处在于，提供一种含有密度增加剂的缓冲液，所述密度增加剂与所述缓冲液的质量体积比在20％‑70％之间，所述密度增加剂用于增加缓冲液的密度，使其密度等于或略小于标记微珠，如此可以有效降低标记微珠的沉降速率或使标记微珠保持在悬浮状态，使其在生成油包水微液滴的过程中保持分散状态，扩大了对微珠尺寸和种类的选择范围。另外，该方法整体具有操作简单、适配性强、可靠性高和成本低等优点。42.在一种实施方式中，所述密度增加剂为蔗糖。所述蔗糖在提高缓冲液密度的同时，对粘度的影响较小。43.在一种实施方式中，所述密度增加剂为聚蔗糖或葡聚糖。44.在一种实施方式中，所述含有密度增加剂的缓冲液中，所述密度增加剂与所述缓冲液的质量体积比在30％‑50％之间。溶液密度随密度增加剂增多而升高。此浓度应根据标记微珠的密度进行调整，使其获得较小的沉降速率。在该浓度范围内可以达到有效维持悬浮的目的，且避免了对下游文库扩增反应的干扰。45.本实施例另一改进之处在于，提供一种用于贮存微珠悬液的细长的储液池，如图2所示，其出口端通过活动接头与微液滴芯片相连；入口端通过活动接头与含有驱动液的管路相连。46.在一种实施方式中，所述储液池的内径为0.4‑4mm，如0.4mm、1mm、2mm或4mm。过小的内径使得容积变小且增加流体阻力，而过大的内径则使标记微珠行程变短。47.在一种实施方式中，所述储液池的长度可以为20‑400mm中的任意数值，具体长度则根据储液池的内径和微珠悬液的体积确定。48.若微珠悬液所需体积为150μl，而储液池的内径为1mm时，则储液池的长度约为190mm。较为细长的储液池增加了标记微珠在重力方向的行程，配合悬浮液起到延迟沉降的目的。49.在一种实施方式中，所述储液池为pdms硅胶软管，便于组装和更换。当然不限于pdms硅胶软管，或其它材料的惰性软管也适用于本实施例。50.在一种实施方式中，所述驱动液为矿物油或植物油等非极性溶剂，其密度小于微珠悬液且不与其混溶。51.本实施例又一改进之处在于，提供一种细胞/细胞核悬液与微珠悬液的混合比例，使混合后的密度增加剂(如蔗糖)终浓度降低，该浓度以下的密度增加剂不会干扰后续的文库扩增反应，满足在微液滴内构建文库所需的条件。52.在一种实施方式中，所述细胞悬液或所述细胞核悬液与所述微珠悬液的混合体积比为大于2：1且小于9:1的任意数值，使混合后的密度增加剂终浓度(质量浓度)降低至10％以下。53.在一种实施方式中，所述细胞悬液或所述细胞核悬液与所述微珠悬液的混合体积比为5：1，使混合后的蔗糖终浓度降为1/6。54.在一种实施方式中，所述含有密度增加剂的缓冲液中，所述缓冲液为高保真pcr缓冲液，如kapa pcr缓冲液和q5 pcr缓冲液等中的一种。55.本实施例中，提取细胞，裂解细胞并对细胞核进行转座酶处理以捕获开放染色质；将标记微珠重悬在含有密度增加剂的高密度悬液中，再将此微珠悬液充入水平放置的储液池中，最后将其两端分别与微液滴芯片和驱动液的管路连接；将经转座酶处理的细胞/细胞核悬液和分离油分别加入相应的含有驱动泵的管路中；将充有微珠悬液的储液池翻转至垂直位置，然后按照一定流速比例运行微流控系统并收集油包水微液滴；利用紫外线照射从微珠表面上释放标记引物；通过pcr反应来扩增染色质开放区的dna片段并添加单细胞标记；破裂微液滴，收集并纯化dna片段；通过再次扩增和纯化得到单细胞atac文库。56.下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明。57.本实施例基于微流控系统构建单细胞atac文库。具体实施步骤包括：58.1.制备细胞核悬液59.通过组织消化和流式分选分离单细胞，重悬在含有体积百分比为2％的fbs的冷的pbs中。检测细胞浓度及活率，活率高于90％为宜。60.按照表1配制转座酶切反应体系：61.表1、转座酶切反应体系[0062][0063]吸取150,000个细胞，在4℃,500g离心力下离心5分钟收集细胞，弃上清。[0064]加入100μl转座酶反应体系，将细胞充分重悬，在37℃，800rpm转速下震荡反应30分钟。反应结束后，加入100μl 20mm edta终止反应，并暂存于冰上。[0065]在上样之前，在4℃,800g离心力下离心5分钟沉淀细胞核，弃去大部分上清，保留约10μl以防扰动沉淀。加入750μl冷的细胞核缓冲液充分重悬混匀，得到细胞核悬液，具体配方如表2所示：[0066]表2、pcr扩增反应体系[0067]成分体积(μl)终浓度5×kapa hifi hotstart缓冲液150μl1倍浓度(1×)dntp mix(10mm)27μl360μmkapa hifi hotstart聚合酶(1u/μl)9μl9u无核酸酶水564μl‑总量750μl‑[0068]2.生成油包水微液滴[0069]2.1准备微流控系统[0070]通过驱动泵向“分离油”、“细胞核”和“微珠”三个管路中分别充入分离油(biorad)，去离子水和矿物油，并排除管路中的气泡。[0071]2.2准备标记微珠[0072]将标记微珠(chemgenes)储液(其中标记微珠分散于含有体积百分比为0.1％tween‑20的tris‑edta溶液中)充分混匀后吸取250μl(～1.3×105个标记微珠)，用200μl相同溶液清洗两次。所述微珠直径约30μm，表面带有大量单链dna分子，作为引物用于文库扩增和单细胞标记。所述dna序列的5’端与微珠表面相连，中间带有一个光敏感基团，可在紫外光照射下分解而将引物从微珠表面释放到溶液中。因此在形成微液滴之前，与标记微珠相关的操作都应在避光或弱光的条件下进行。[0073]本实施例的dna序列包括四部分：光敏感基团(pc‑linker)、29nt的p5接头、12nt的随机细胞标签(j)和14nt的nextera接头，其序列为：5’‑bead‑/pc‑linker/‑aatgatacggcgaccaccgagatctacacjjjjjjjjjjjjtcgtcggcagcgtc‑3’。所述dna序列由chemgenes公司在凝胶微珠上以反向合成方法(5’‑3’)制备。[0074]2.3加样[0075]将洗涤过的标记微珠均匀重悬在150μl含有48％(w/v)蔗糖的pcr缓冲液中，再将此微珠悬液注入水平放置的细长储液池中，最后在入口端加入矿物油，使液体充满整个储液池并排除气泡。本实施例的储液池为长度190mm、内径1mm、外径3mm的硅胶软管。储液池的尺寸可根据所需微珠悬液的体积确定。[0076]排除储液池的气泡后将入口端与含有矿物油的管路连接，将出口端与微液滴芯片(dolomite)的管路连接，并确保整条通路中没有气泡。[0077]将750μl充分混匀的细胞核悬液加入“细胞核”管路中。[0078]将装载微珠的储液池竖直翻转并固定，使液体自上而下流动。[0079]以10μl/min的低流速运行三个驱动泵，直至各路均有液体从芯片适配器出口流出。[0080]将适配器与微流控芯片连接并锁紧。至此已完成微流控的准备工作。[0081]2.4运行[0082]以低流速开始驱动液流。其中，三个驱动泵的起始流速分别为“细胞核”20μl/min，“微珠”5μl/min，“分离油”40μl/min。[0083]待流速稳定后，提高至正常流速。其中，三个正常流速分别为：50μl/min，10μl/min和200μl/min。在此流速下，细胞核悬液与微珠悬液以5：1的体积比混合，所得溶液为含有8％蔗糖(w/v)的1×pcr体系。[0084]在此流速下，油包水微液滴的生成率约为2800/μl，平均直径～88μm(容积～360pl)。理论上微液滴内包裹单个细胞核的比例约为1/20，含有单个标记微珠的比例亦约1/20，同时包裹两者的比例约为1/400。因此，对细胞核的理论捕获率约5％。[0085]所述比例使得同时包裹多个细胞核或微珠的概率极小，保证了单细胞文库的可靠性。可选的，增加标记微珠的上样密度可以提高对细胞/细胞核的捕获率，随之增加的多重标记情况可以通过针对染色质开放区的重复序列分析进行甄别。[0086]将生成的油包水微液滴和分离油收集在数个1.5ml离心管中。收集完成后利用宽口移液枪头将上层乳白色的微液滴转移至0.2ml 8联pcr管中，每管100μl。所得油包水微液滴如图3所示，可见标记微珠均匀分布在微液滴中。[0087]3.atac文库的扩增和测序[0088]3.1紫外曝光[0089]将装有微液滴的pcr管平放于302nm uv灯下约6cm处，曝光4min。此波长紫外光将dna标记引物从微珠表面释放至溶液中。[0090]3.2线性扩增[0091]在pcr仪(thermo t100)中对样本进行线性扩增，程序如表3：[0092]表3、pcr扩增反应程序[0093][0094][0095]扩增完成后进行回收，向每个pcr管中加入100μl 20％(v/v)pfo‑hfe7500，静置1min待微液滴破裂。吸取上面水相至新的离心管中，通过离心再回收来除去残余分离油和微珠沉淀。[0096]利用dna纯化试剂盒(qiagen minelute)纯化dna，溶解在20μl eb溶液中。[0097]3.3第二次扩增[0098]利用kapa高保真pcr扩增文库并添加i7 index。两端引物分别为p5引物和indexed p7引物。退火温度为65℃，最佳循环数可通过荧光定量pcr确定。[0099]扩增后的文库用1.2倍体积的吸附磁珠(vazyme)进行纯化，最终溶解在te溶液中。采用qubit dsdna定量试剂测定文库浓度，采用agilent‑2100分析仪检测文库分布。[0100]3.4测序[0101]采用illumina测序仪进行测序，模式为pe50加双端index；其中i5作为细胞标签测量12bp，而i7作为样本标签测量8bp。测序数据量可根据细胞数及测序深度确定，可选的数据量为每个细胞20,000reads。[0102]文库中插入片段的长度(fragment length)分布如图4所示，可见平均长度约为40bp、200bp、360bp的分布峰值，分别对应在无核小体、单核小体和双核小体位置的插入片段。经数据去重后，每个细胞中插入片段的frip(位于峰区的序列段占比，fraction of reads in peaks)分布如图5所示，该比例平均在0.6以上。图6显示了每个细胞标签中有效非重复数据量(unique fragments)和插入片段的转录起始点富集值(tss enrichment)，可见主要细胞群的非重复数据量可达4000以上，tss值可达10以上。这些数据符合正常的单细胞atac文库的特征，可以用作进一步分析。[0103]4.不同浓度的蔗糖对文库扩增反应和产物的影响[0104]当油包水微液滴内蔗糖的质量体积百分比浓度不大于10％时，对高保真文库扩增反应的速率没有显著影响，如图7中(a)的荧光定量扩增曲线所示，含有各浓度蔗糖的kapa pcr扩增曲线基本一致。同时，上述不同浓度的蔗糖对文库扩增产物的长度分布亦无显著影响，如图7中(b)和图7中(c)所示，前者为经kapa pcr扩增的atac文库的片段分布，后者则显示由q5 pcr体系扩增的atac文库。以上结果表明，以起始浓度在20％‑70％之间的蔗糖作为密度增加剂，经过大于2：1且小于9：1的相应比例稀释，使其在微液滴内的终浓度为不大于10％的任意数值时，不会影响对dna文库的扩增。[0105]综上所述，本发明提供了一种用于构建单细胞文库的微流控方法。所述方法采用高密度溶液作为单细胞标记微珠的悬浮液，采用具有一定高度的细长管路作为微珠悬液的贮存池，利用矿物油作为该管路的驱动液；所述高密度溶液极大地降低了大比重标记微珠在贮存池中的沉降速率，达到了在微流控过程中维持微珠均匀分散的目的；在形成油包水微液滴过程中，所述高密度缓冲液以一定比例与细胞/细胞核悬液混合，其溶质被稀释至低浓度，使下游文库标记和扩增反应得以进行。本发明解决了单细胞标记微珠在微流控过程中易发生沉降，进而影响文库制备的问题；所述方案适用于一系列密度和尺寸的标记微珠，扩展了选择范围，包括价格较低、非商业化或自主设计的产品，进而降低了单细胞文库的制备成本。另外，所述储液池及连接方案结构简单、操作方便，可选择合适的容积而避免浪费；其易于更换的特性适合连续制备多个文库。[0106]应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。