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前言

蛋白质聚集（Protein Aggregation）是蛋白质发生错误折叠、构象改变而形成聚体的生物学现象。在蛋白类药物的发酵、纯化、制剂、储存、甚至给药过程中，蛋白质聚集的现象广泛存在，形成的聚体可能导致蛋白丧失活性、增加免疫原性，严重影响蛋白的质量指标和生产应用。在生物制药领域，蛋白质聚集是药物研发和商业化过程中的重要挑战。

2018年10月，拜尔公司联合特拉华大学Roberts CJ发表在International Journal of Pharmaceutics（1区, IF: 6.510）的文章：《Protein aggregation - Mechanisms, detection, and control》，详细阐述了蛋白质聚体的形成机制、影响因素、及聚体的检测与控制方法。作为重组蛋白类CDMO从业人员，菌菌仔细阅读了该篇文章，颇有受益，故将文章内容分享如下：

蛋白质聚体的形成机制

蛋白质聚集通常经过一系列由内而外的变化过程。首先，蛋白质的内部结构发生改变，影响蛋白-蛋白间的相互作用，导致二聚体或寡聚体的形成，随后聚体生长或聚集，形成可见颗粒。

初始寡聚化/成核（Initial oligomerization / nucleation）

蛋白质存在固有构象扭曲或局部构象不稳定的现象，这类结构变化可能暴露聚集倾向性序列或“热点序列（hot spot）”，形成易于聚集的单体，进而与其他单体结合形成二聚体或寡聚体，作为初始聚集事件，也称成核。据文献报道，这些“热点序列”位于蛋白的不同区域，如单克隆抗体的Fab结构域。如图1所示，一个折叠的单克隆抗体包含两个相同的抗原结合Fab结构域和一个保守的Fc结构域，其中Fab结构域包含决定抗原表位特异性和亲和力的氨基酸序列，通常需要一定程度的构象扭曲或“错误折叠”，这一构象变化导致聚合倾向性的氨基酸延伸（即“热点序列”）暴露出来，从而诱导蛋白质单体聚集成可溶性寡聚体或多聚体。蛋白质是带电荷的两性聚合物，可在不同的浓度和溶剂条件下，合成不同大小的寡聚体。蛋白质聚集过程可能涉及多种类型的蛋白间相互作用，如疏水作用、静电作用、氢键、范德华力。据报道，蛋白质浓度增加会缩小蛋白间的空间距离，从而使蛋白质彼此“靠近”，促进单体缔合产生寡聚体或多聚体，即蛋白间相互作用具有浓度依赖性。低pH、不稳定剂/有机溶剂或压力等不当的溶剂条件可能导致蛋白质的局部构象不稳定，蛋白聚体的初始成核速率与构象的稳定性和柔性相关。

聚体生长（Aggregate growth）寡聚体成核后生长成较大的多聚体，这一过程为聚体生长，可通过多种机制发生，包括单体加成、链式聚集、聚体-聚体（或聚簇-聚簇）间相互作用或凝聚。与成核类似，聚体的生长也受蛋白构象稳定性或胶体稳定性的影响。由于成核和初始聚体的数目随时间的延长而增加，聚体生长呈指数增长，如下图所示。随着蛋白质聚体的不断增大，最终形成不溶性颗粒，其形态多样性与疏水性或芳香族氨基酸的相对数量和聚合阶段有关。有研究显示，随着时间的推移，不溶性蛋白颗粒会部分解离为可溶性聚合物。

蛋白质聚集的影响因素

蛋白结构（Protein structures）

蛋白质的一级序列和疏水氨基酸的占比，可影响聚合速率与聚体的稳定性。有研究报道，疏水氨基酸可形成聚集倾向序列，将亲水氨基酸替换为疏水氨基酸或不同疏水氨基酸的替换可显著增加蛋白质的聚集率。蛋白质的二级结构可控制其聚集倾向。有研究显示，冻干诱导的蛋白聚集与β-折叠有关。对于存在游离二硫键的蛋白质，其二级结构影响硫醇-二硫键交换的速率，从而影响化学介导的聚集速率。蛋白质的三级结构也影响蛋白质的聚集。疏水基团等聚集倾向性区域促进蛋白质的聚集，可使用带电残基或脯氨酸包埋以减少蛋白聚集。蛋白质的糖基化修饰可维持蛋白质的稳定性。关于单克隆抗体的研究显示，CH2结构域的糖基化可维持CH2结构域及整个单抗分子的稳定性。同时，单抗的去糖基化会破坏CH2区域的三级结构，使Fab和Fc区域不稳定，加速聚体的产生。此外，糖链结构也通过影响蛋白构象的稳定性而改变蛋白质的聚集倾向。

化学降解（Chemical degradation）

蛋白质的降解途径有氧化、光照、脱酰胺、结晶或去二硫键，可通过改变蛋白构象或胶体稳定性，从而影响蛋白质的聚集效应。

蛋白质的氧化可增强聚集倾向，主要归因于：①蛋白表面疏水性增强；②聚体间相互作用增强；③蛋白质构象稳定性降低。

蛋白质的糖基化可将表面正电荷转化为中性或负电荷，放大其暴露的疏水表面。另一方面，广泛地糖基化可阻止蛋白质聚集，对蛋白质进行糖基化修饰是减少蛋白质聚集的一种策略。

蛋白质的脱酰胺可增强聚集倾向，归因于脱酰胺化引入负电荷，潜在改变蛋白间的静电作用.

抗体-药物偶联（ADC, Antibody-drug conjugates）对蛋白的影响在少数研究中有报道，小分子疏水药物增加了蛋白质的疏水表面，影响蛋白质的构象稳定性。因此，随着药物-抗体比的增加，蛋白的聚集效应逐渐增强。

温度（Temperature）

有研究报道，温度过高可加速蛋白质的聚集过程，主要通过去折叠蛋白的占比和蛋白的扩散和碰撞速率。同样，温度过低也可能导致蛋白质的去折叠，增强聚集效应。温度主要通过改变溶剂的性质影响蛋白质的聚集，包括蛋白扩散速率、蛋白间相互作用、蛋白或聚体的溶解性、构象稳定性和化学降解。

溶剂条件（Solution conditions）

溶液pH会影响蛋白的构象和胶体稳定性，从而影响蛋白质的聚集。改变溶液pH可改变蛋白间相互作用、蛋白聚体的溶解度、蛋白质交联反应及聚体的成核和生长。

离子强度是蛋白聚集的另一影响因素，主要通过影响构象稳定性、蛋白间相互作用实现。盐溶液中阳离子和阴离子能与蛋白分子发生特异性结合，可用来调节蛋白质的聚集。

配方辅料或添加剂

可影响蛋白间相互作用，常用于减少蛋白质在体积溶液中的聚集，而在某些条件下，添加剂会增强蛋白的聚集。

制备过程（Processes）冷冻

可诱导蛋白聚集，由于低温诱导的变性或结构不稳定、冰诱导的蛋白质吸附或变性、部分成分的选择性结晶、蛋白浓度等因素。

机械作用：离心、过滤、搅拌及泵送可诱导蛋白质或多肽的聚集效应，归因于形成气液界面发生蛋白吸附、去折叠与聚集，以及剪切应力、疏水表面暴露，如搅拌棒和研磨搅拌。

光照可在蛋白质中诱导多种光解和非光解的产物，这些降解产物中可能包括具有增强聚集倾向的聚集体或单体。研究表明，在某些情况下，抗体溶液暴露在紫外线或可见光下会形成高分子量聚集体。

发酵过程中培养基条件、细胞密度、诱导温度等会影响蛋白的折叠修饰，从而促进聚体形成，常见的案例有大肠杆菌发酵中形成包涵体。

纯化过程中洗脱溶剂（pH、盐浓度）、色谱柱配体与骨架可能导致聚体形成。使用ProteinA亲和层析过程中，较低的pH值可能影响蛋白的稳定性；疏水层析过程中层析填料与蛋白间的强疏水作用也可能导致聚体形成。

干燥过程会去除少量蛋白质水化层，会导致蛋白质的聚集。一些蛋白质在冻干或喷雾干燥过程中形成聚体。

蛋白质聚体的检测

可溶性聚体

可溶性蛋白聚体可使用体积排阻高效液相色谱（SEC-HPLC）检测，2020年版本的《中国药典》推荐：SEC-HPLC用于人血白蛋白多聚体与人免疫球蛋白类制品IgG单体加二聚体的测定，流动相为含1%异丙醇的0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）为流动相，上样量要求为20μl浓度为12mg/ml的待测样品。该方法可检测大多蛋白聚体，但也存在一定的局限性，包括样品在色谱柱中稀释导致的聚体解离、流动相或高压诱导的蛋白质聚集、系统有限的分辨率和分析范围（＜MDa）。其他可选方法包括原位动态光散射（DLS）、泰勒色散分析（TDA）、原子力显微技术、电喷雾差分迁移率分析（ES-DMA）等。

不溶性聚体

不溶性聚体包括亚可见颗粒（