转自：诺泰生物

近年来寡核苷酸药物的研发企业备受资本青睐。寡核苷酸药作为一款极具潜力的创新药，屡获美国FDA和欧洲EMA批准上市，为缺乏治疗手段的遗传病和罕见病带来曙光。是现代新药的新一轮浪潮。目前已经获批上市的核酸药共有15款（如图1），其中诺西钠生钠22年销售额达到17.94亿美元，依特立生从19年的3.8亿美元增长到22年的5.12亿美元，帕替司兰钠从19年的1.7亿美元增长到22年的5.58亿美元，还有其它一些单品的全球销售额都在稳步增长，可以说寡核苷酸药物未来发展的空间是非常巨大。而寡核苷酸的合成离不开核苷酸单体。

一.核苷酸及其组分简介

核酸定义：是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。核酸的相对分子质量很大，一般是几十万至几百万。核酸水解后得到许多核苷酸单体，所以核苷酸单体是组成核酸分子的单体。核苷酸单体由碱基（嘌呤碱或嘧啶碱）、核糖（核糖或脱氧核糖）以及磷酸三种物质组成的化合物。（图2）

1磷酸和磷酸基团

2戊糖（五碳糖）

注：脱氧核糖于核糖的不同在于2号未上一个是-H而另一个是-OH脱氧核糖核苷酸中的戊糖是β-D-2脱氧核糖，核糖核苷酸中的戊糖是β-D-核糖，这一结构上的差异使得DNA分子在化学更为稳定，从而被自然选择作为生物遗传信息的储存载体。

3碱基：

[主要碱基]：构成核酸（DNA和RNA）的主要碱基

注:DNA和RNA除了核糖不同以外，其碱基也存在一定的差异，DNA含有的碱基有A、T、G、C，而RNA中的碱基则为A、U、G、C。其中一个碱基存在不同， 其实从上图中不难看出，T和U结构上很相似，对比可以发现T比U多了一个甲基，从另一方面来说，T可以看成是U的修饰体，即T是由U甲基化修饰后形成的。可能DNA就是因为U被甲基化修饰成了T而不易被某些酶降解因此更稳定。RNA在进化上很可能是先于DNA出现，自然界选择DNA代替RNA作为遗传物质的载体一个原因就是DNA更稳定。

二.核苷酸单体的结构及修饰

1核苷酸单体结构

（1）核苷：碱基和核糖或脱氧核糖通过糖苷键缩合形成核苷或脱氧核苷，连接位置是核糖或脱氧核糖上的1号位置。种类有：腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷、胸苷。

（2）核苷酸：核苷或脱氧核苷通过酯键结合形成核苷酸或脱氧核苷酸

注：尽管核糖环上的所有游离羟基（核糖的2、3、5号位及脱氧核糖的3、5号位）均能与磷酸发生酯化反应，但生物体内多数核苷酸都是5号位核苷酸，即磷酸基团位于核糖的第五位碳原子上。种类：核苷酸中的磷酸有一分子、两分子及三分子几种形式。

核苷酸

核苷一磷酸（NMP）

AMP、GMP、CMP、UMP

核苷二磷酸（NDP）

ADP、GDP、CDP、UDP

核苷三磷酸（NTP）

ATP、GTP、CTP、UTP

脱氧核苷酸

脱氧核苷一磷酸（dNMP）

dAMP、dGMP、dCMP、dTMP

脱氧核苷二磷酸（dNDP）

dADP、dGDP、dCDP、dTDP

脱氧核苷三磷酸（dNTP）

dATP、dGTP、dCTP、dTTP

细胞中核糖核苷酸的浓度远远超过脱氧核糖核苷酸,前者约在mmol范围,而后者只在umol水平。

2核苷单体的修饰

自然状态下的小核酸结构容易被体内核酸酶降解，药代动力学性质差等原因，一般不能作为药物使用，需要对核苷进行多位点的化学修饰，核苷酸单体的修饰主要是对糖环和磷酸骨架及碱基进行修饰，目的是为了a. 引入化学修饰增强了寡核苷酸的稳定性;b. 增加了他们对靶标的亲和力，促进细胞摄取。c. 提高了它们的体内生物利用度。

（1）第一代寡核苷酸单体修饰

硫代磷酸酯修饰：

注：作为第一代寡核苷酸单体修饰，其将核苷酸单体中的磷酸骨架中的一个非桥氧用硫进行替换，其形成的硫代磷酸酯键的核酸酶抗性更强，并改造可增强其与血浆蛋白的结合能力，降低肾脏清除速率，提高半衰期。其是ASO药物中比较常见的化学修饰。如已上市的Fomivirsen，Mipomersen，Nusinersen，Inotersen中都可见到该修饰方法。

（2）第二代寡核苷酸单体修饰

1）2'-OMe修饰

注：2'-OMe修饰是将核糖核苷酸的2'-羟基替换为甲氧基。修饰后的核苷酸单体使用到寡核苷酸药物中后，增加了与互补RNA的亲和力降低免疫原性，同时也增加了寡核苷酸对于核酸酶的抗性。其常被用于ASO、适配体、SiRNA中，目前上市的寡核苷酸药品中Volanesorsen、Patisiran、Pegaptanib、Inclisiran都使用了2’-OMe修饰。

2）2'-MOE (2-O-(2-methoxyethyl)) 修饰

注：2'-MOE 修饰将核糖核苷酸2号位羟基上的氢替换为MOE(甲氧基乙基)，修饰后的核苷酸单体用到寡核苷酸药物后，可延长寡核苷酸药物半衰期，提高了与互补RNA的亲和力，同时也增加了对核酸酶的抗性。在ASO中使用较多，目前已上市核酸药Mipomersen、Nusinersen、Inotersen中均用到了该修饰。

3）2'-F修饰

注：2'-F修饰是将核糖核苷酸2号位上等的羟基替换为F原子。与2'-OMe和2'-MOE修饰一样，其使用到寡核苷酸中可提高可寡核苷酸与互补RNA的亲和力，提高其对核酸酶的抗性。其在SiRNA、适配子中均有使用，已上市寡核苷酸药物中Inclisiran、Pegaptanib使用了该修饰。

（3）第三代寡核苷酸单体修饰

1）肽核酸（PNA）

注：肽核酸（PNA）是一种通过用多肽来替换糖磷酸主链的修饰方式，它是一种寡核苷酸类似物，与常规寡核苷酸相比其不容易被核酸酶降解，与基因靶位形成的双链或三链结构更稳定，且较容易通过细胞膜被传输到细胞中，而且PNA与相应的DNA、mRNA的转录及翻译的启动位点结合后，可以抑制相应的转录及翻译过程，这是其在反义药物的研究上具有较大的潜在应用价值。

2）PMO

注：PMO修饰是呋喃糖环已被吗啉环取代，且每个吗啉环通过电中性的磷酰二氨基连接。PMO的电中性使其对靶标更有亲和力，对核酸酶的抗性更强。目前FDA已经批准的PMO药物主要有两款，Eteplirsen和Golodirsen它们分别靶向肌营养不良蛋白mRNA的外显子 51和53，踊跃治疗杜氏肌营养不良症（遗传性肌肉萎缩病）。

3）锁核酸（LNA）

注：锁核酸（LNA）修饰是亚甲基桥在2号位羟基和4号位C之间形成共价键，形成桥接双糖环基。在寡核苷酸中加入LNA可提高与靶标的亲和力，同时与靶标互补后的双链有很强的热稳定性，其对核酸酶的抗性得到增强，同时能自由通过细胞膜，且在体内无毒性。

三．常见的核苷酸单体和核苷酸保护基团

1.常见的核苷酸单体

目前大部分寡核苷酸药物都是采取固相亚磷酰胺化学方法进行合成，其中核心物料核苷酸亚磷酰胺单体是小核酸合成的关键物料。亚磷酰胺单体主要由碱基、核糖、5’-DMT和3’端的2-氰乙基以及二异丙胺组成。以下是常见的亚磷酰胺单体。6种常见类型，有无数种组合，Base为碱基，P为保护基，X=H的为DNA，X=OH的为RNA

2.核苷酸单体保护基

保护位置

保护基名称

英文

缩写

脱保护方法

磷酸保护基

β-氰乙基

β-cyanoethyl

N/A

20%TEA in ACN(PH=10-11)

20%DEA in ACN(PH=10-11)

O-甲基

O - methyl

N/A

硫酚处理30-45min

羟基保护基

二甲氧基三苯甲基

Dimethoxytrityl

DMT

10%二氯乙酸甲苯溶液

碱基上的保护基

苯甲酰基

Benzoyl

Bz (A,C)

25%氨水溶液处理 55℃，5小时

异丁酰基

Isobutyryl

Ib (G,C)

二甲基脒

Dimethylformamidines

Dmf(A,G,)

苯氧乙酰基

Phenoxuacetyl

PheAc(A,G)

四．总结：

以上就简单地介绍了寡核苷酸单体的一些组成、结构、修饰以及相应作用。以PS为代表的第一代寡核苷酸单体增强了其对核酸酶的抗性，PSDNA在体外人血清中半衰期为9-10小时，未修饰的约为1小时。此外PSDNA会形成Watson-Crick碱基对激活RNase H携带负电荷用于细胞递送，并显示出良好的药代动力学特性。以2’-OME,2’-MOE,2’-F等为代表的第二代寡核苷酸单体可进一步增强对核酸酶的抵抗，并可以增强其与互补核苷酸链的结合能力。以LNA, PNA，PMO为代表的第三代增强了核酸酶的抗性和寡核苷酸对靶RNA的亲和力，核苷酸单体是寡核苷酸生产的基础，其修饰实现了小核酸药物的成药，随着小核酸药物的火热，核苷酸单体行业也得到了迅猛发展，而核苷酸单体的发展同时加快了小核酸药物研发和商业化。两者相辅相成，正向循环。

资料来源：

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2.Rüger, J., Ioannou, S., Castanotto, D., & Stein, C. A. (2020). Oligonucleotides to the (Gene) Rescue: FDA Approvals 2017-2019. Trends in pharmacological sciences, 41(1), 27–41.

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4.Muhonen, P., Tennilä, T., Azhayeva, E., Parthasarathy, R. N., Janckila, A. J., Väänänen, H. K., Azhayev, A., & Laitala-Leinonen, T. (2007). RNA interference tolerates 2'-fluoro modifications at the Argonaute2 cleavage site. Chemistry & biodiversity, 4(5), 858–873.

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10.药智网数据库

撰稿人：郑云杰