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作者：

李艳华

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摘要：

当体内高半胱氨酸(Hcy)含量异常升高时会严重损害DNA的修复机制,诱导细胞的凋亡,进一步就会引起阿尔茨海默综合症(AD),高半胱氨酸血症,冠心病等.体内Hcy的生成是由S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosyl-homocysteine hydrolase,SAHH,E.C.3.3.1.1)催化S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocystein,SAH)可逆水解生成腺苷(Ado)和Hcy.细胞中Hcy的生成只有水解SAH这唯一的一条代谢途径,所以体内Hcy含量的高低与SAHH蛋白酶有着密切的关系.本实验旨在通过体外合成具有生物活性的SAHH,并且以该SAHH为研究基础筛选得到可以抑制SAHH活性的抑制剂.此抑制剂的发现为有效地治疗以及防止AD,高半胱氨酸血症,冠心病等老年性疾病提供了新的,更有效的临床治疗方法.本论文通过基因克隆技术将sahh克隆到p Pic9k质粒中构建p PIC9K-sahh重组表达质粒.该重组表达质粒在限制性内切酶——Bgl II的作用下酶切,酶切后目的基因通过电转化的方法整合到毕赤酵母菌(P.pastoris)GS115的基因组.为了得到高抗性的转化子,我们利用不同梯度浓度的G418遗传霉素进行高抗性筛选,最终筛选得到高拷贝,高抗性的转化子.将筛选到的高拷贝转化子通过菌体的PCR进行扩增,鉴定其为阳性的转化子.得到的阳性转化子在1%的甲醇诱导下表达目的蛋白SAHH.随后收集目的蛋白进行镍柱纯化,纯化后的SAHH用DTNB定量的检测其酶活,其比活为105 U/mg.为了进一步更好的了解此酶,本实验还进行了酶促反应动力学研究,探究得到该水解酶的K_m=21.8μM,V_(max)=22.9μM/min,最适的T=41℃,最适p H=6.5.我们利用Chem Mapper,Sci Finder Scholar等信息平台来进行抑制剂的初步筛选.通过DTNB试剂检测其酶活的变化情况来进一步的筛选,从而确定具有抑制效果的SAHH的抑制剂.最终成功筛选得到一种抑制效果相对较高的小分子化合物——4-(3-Hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenol(松柏醇),其半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))为34.04nM.

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