实验三 汉防己生物碱的提取、分离和鉴定

一、前言

汉防己（粉防己）是防己科千金藤属植物石蟾蜍Stephania tetrandra S.moore的根，具有解热镇痛作用，中医用于祛风、止痛、利尿、消肿及治疗毒蛇咬伤等。其有效成分是生物碱，总碱含量约为2%，主要有汉防己甲素、汉防己乙素及轮环藤酚碱。汉防己甲素具有镇痛、消炎、降压、肌松、抗菌、抗肿瘤、抗矽肺、抗结核、抗心律失常（Ca2+）抑制血小板凝集等作用。汉防己乙素具有镇痛、消炎、降压、抗肿瘤、抗血小板凝集等作用。轮环藤酚碱具有松弛横纹肌、阻断神经节、降压、抑制胃收缩等作用。汉防己中主要成分的物理性质如下。

1. 汉防己甲素（粉防己碱，tetrandrine）:C38H42O6N2，无色针状结晶（丙酮），有双熔点现象。结晶在126℃～127℃是熔融，153℃是固化，温度上升至217℃～218℃是复又熔化。[a]25n为+297。（c=1.00,CHCl3），与碘甲烷反应生成碘化二甲基汉防己甲素（汉松肌，C40H48O6N2·I2）。汉防己甲素不溶于水、石油醚，易溶于甲醇、乙醇、乙醚、氯仿和苯中，亦溶于稀酸水溶液中。UVλEtOHmaxnm(lgε):282.5  (3.88)。

2. 汉防己乙素(防己诺林碱,fangchinoline):C37H40O6N2，本品为细棒状结晶（丙酮），有双熔点现象，熔点为134℃～136℃和238℃～240℃。 [a]25n为+275.（c=0.57,CHCl3），与溴甲烷反应生成溴化二甲基汉防己乙素（汉松敏，C39H46O6N2·Br2）。本品溶解度与汉防己甲素相似，但极性稍大，故在冷苯中的溶解度小于汉防己甲素，具有隐性酚羟基，不溶于NaOH溶液中。UVλEtOHmaxnm(lgε):282  (3.99)。

3. 轮环藤酚碱（汉己素，cyckabikube）:C20H24N+，氯化物为无色八面体结晶，mp214℃～216℃，其碘化物为无色丝状结晶，mp185℃，[a]30n为-120（c=0.67，MeOH）。易溶于水、甲醇、乙醇，难溶于低级性有机溶剂中。UVλEtOHmaxnm(lgε):232  (4.11)，284（3.83）。

二、实验部分

2.1 实验目的

1、掌握总生物碱的提取及脂溶性生物碱和水溶性生物碱、酚性叔胺碱及非酚性叔胺碱、水溶性碱与水溶性杂质的分离、纯化和方法。

2、学习用吸附色谱法分离生物碱的操作技术。

3、掌握生物碱的鉴定方法。

4、学习生物碱衍生物的制备方法。

2.2 实验原理

根据大多数生物碱或生物碱盐均能溶于乙醇的通性，利用乙醇回流提取总生物碱。利用季胺型生物碱易溶于水，不溶于亲脂性有机溶剂的性质，用溶剂萃取法分离脂溶性生物碱和水溶性生物碱；根据汉防己甲素和乙素结构上的差异，用吸附柱色谱分离二者，或利用汉防己甲素的极性小于乙素，在冷苯中溶解度比汉防己乙素大加以分离；利用季胺型生物碱可与雷氏铵盐产生沉淀的性质，使季胺型生物碱与其他水溶液成分分离。

2.3 实验原材料及仪器

实验原料：汉防己

实验试剂：95%乙醇，1%盐酸，二氯甲烷，浓氨水，1%氢氧化钠，dragendorff 试剂，丙酮，中性氧化铝，硅胶G，CMC-Na，甲苯，20%盐酸，雷氏铵盐，0.6%硫酸银，10%氯化钡，10%氢氧化钾，碘甲烷，甲醇，乙醇，环己烷，无水硫酸钠，苦味酸试剂，碘-碘化钾试剂，硅钨酸试剂，碘化铋钾试剂。

实验仪器：量筒，烧杯，500ml园底烧瓶，回流冷凝管，锥形瓶，250ml分液漏斗，蒸发皿，试管。

2.4实验内容

2.4.1 总生物碱的提取

称取汉防己粗粉100g，置于500ml圆底烧瓶中，加95%乙醇浸没药材（约需300ml），水浴上加热回流1h后，过滤，滤液置于锥形瓶中，药渣再用95%乙醇200ml同法提取一次，每次30min，合并两次滤液。如有絮状物析出，再过滤一次，澄清溶液浓缩至无醇味，成糖浆状，得到总生物碱。

2.4.2 亲酯性生物碱和亲水性生物碱的分离

将糖浆状总提取物置于锥形瓶中，逐渐加入1%盐酸100ml左右（生成季铵盐，溶解在水中），同时充分搅拌，促使生物碱溶解。不溶物呈树脂状析出下沉。静置，滤出上清液，再用1%盐酸少量多次洗涤不溶物（充分溶解残留的生物碱，使其生成季铵盐），直至洗液对生物碱沉淀试剂反应微弱为止。

将盐酸提取液置于分液漏斗中，用二氯甲烷洗3次（二氯甲烷溶解非生物碱成分），每次用酸水液的1/3量，合并二氯甲烷洗液，再用1%盐酸洗二氯甲烷混合液1-2次（把二氯甲烷中的生物碱让其变为季铵盐溶于水中），将洗涤二氯甲烷的酸液和酸水提取液合并，留取10ml作沉淀反应，二氯甲烷层弃去（不含生物碱，是其他亲酯性成分），其余的酸水液移至分液漏斗中，加75ml二氯甲烷，滴加浓氨水调至pH9~10（季铵盐和氨水反应，释放出生物碱），振摇萃取，静置分层后放出二氯甲烷层（亲酯性生物碱溶于二氯甲烷中），碱水层在再用新的二氯甲烷萃取4次-5次（彻底把亲酯性生物碱提到二氯甲烷中），每次用二氯甲烷萃取40ml，直到二氯甲烷萃取液生物碱反应微弱为止（取二氯甲烷液滴在滤纸上喷碘化铋钾（Dragendorff）试剂显色不明显）。氨性碱水液留待分离水溶性生物碱。二氯甲烷液置于分液漏斗中，先以1%氢氧化钠溶液洗两次后（酚性生物碱和NaOH反应，成盐），再用水洗2次~3次，碱水液和水液合并，为含酚性生物碱部分。二氯甲烷液用无水硫酸钠脱水，蒸去二氯甲烷至干，得脂溶性粗总碱（汉防己甲素、汉防己乙素的混合物）。

2.4.3 汉防己甲素和汉防己乙素的分离

方法一  柱色谱分离法

取100ml总碱，用少量丙酮溶解，将0.5g～1.0g色谱用氧化铝（作吸附剂）置于小蒸发皿中，滴加样品丙酮于吸附剂中分散均匀，加热挥去丙酮，研细样品备用。取中性氧化铝100目30g，装于2.5cm×25cm的色谱柱中，将含有样品的吸附剂均匀的加于柱顶，用环己烷-丙酮（4：1）洗脱，流速控制在5ml/min，收集各流分（10ml～15ml/份），回收溶剂，用硅胶G-CMC-Na薄层板做检查，同时点汉防己甲素、汉防己乙素乙醇溶液作对照。展开剂为二氯甲烷-丙酮（1:1），上行展开，在层析缸里放一小杯氨水，展开前饱和15min，用改良Dragendorff试剂显色，记录图谱及斑点颜色。合并相同流分，回收溶剂至干，分别用丙酮重结晶，可得汉防己甲素、汉防己乙素纯品。

注：强调氧化铝上柱与硅胶上柱的本质区别：生物碱为碱性只能用碱性氧化铝上柱，如果用硅胶（酸性）可能反应上，难以洗脱。

氨水先饱和薄层板，否则生物碱吸附在硅胶柱上，展不上去。

环己烷-丙酮=4:1

方法二  溶剂分离法

将粗总碱置于25ml三角烧瓶中，加5倍量的冷甲苯，密闭冷浸，时时振摇，1h后过滤，以少量甲苯洗涤不溶部分合并甲苯溶液，回收甲苯至无甲苯的臭味，残留物以丙酮重结晶，得细棒状结晶，为汉防己甲素，再经数次重结晶至熔点恒定、色谱显示一个斑点为止。甲苯不溶物待挥去残留的甲苯后，也用丙酮重结晶，可得粒状结晶，为汉防己乙素，再经数次重结晶，测熔点，进行色谱鉴定（薄层色谱条件同。

注：溶剂无法得到纯晶体，学生实验此方法不做。

经集体备课，高老师和陈老三建议取消这一步操作，量太少，而且此方法也不是常用的方法。只做柱分离。

2.4.4 季胺型生物碱的分离纯化

2.4.2中的氨性碱水液，加20%盐酸调至pH3～4，滴加雷氏铵盐的饱和水溶液至不再生成沉淀为止（季铵盐在酸性条件下与硫氰酸铬铵生成不溶性沉淀，复盐）。滤取沉淀，用少量水洗涤，抽干，自然干燥，称重，加20倍量的丙酮溶解，自然过滤，滤去不溶物，丙酮液通过氧化铝柱除杂质，并用丙酮溶液（丙酮:水=5:1）洗至流出液颜色极浅为止，在此洗脱液中加入0.6% 硫酸银(Mr：203.94，2.9X10-5mol/ml=0.000029mol/ml)溶液至不再生成沉淀（记录硫酸银溶液的体积）（复盐和硫酸银反应，生成硫氰酸铬银）。放置，自然过滤，弃去沉淀。滤液回收大部分丙酮（含有硫酸盐生物碱），放冷（如有沉淀物再过滤），小心加入与硫酸银溶液等量（等物质的量或等摩尔量）的10% 氯化钡（Mr：208.23,0.00048mol/ml）溶液（硫酸盐生物碱转化为盐酸盐生物碱，同时生成硫酸钡沉淀）至白色沉淀不再生成为止，放置，自然过滤，滤液转入蒸发皿中，水浴上浓缩至小体积（约2ml～3ml），趁热转入小三角瓶中，放置析出无色结晶，得轮环藤酚碱盐酸盐，如有必要可再用水重结晶一次。

注：经集体备课，建议取消这一步操作，含量太少，无法得到晶体。只做柱分离。

2.4.6 鉴定

1.沉淀反应

取留作沉淀反应的酸水液，分别置于4支试管中，加下列试剂1滴～3滴，观察现象：

（1） 苦味酸试剂（现将酸水液调至酸性，再滴加试剂。）

（2） 碘-碘化钾试剂

（3） 硅钨酸试剂

（4） 碘化铋钾试剂

1-2种鉴别就行。

2.色谱鉴定

（1）汉防己生物碱色谱条件

薄色板：硅胶G-CMC-Na板。

点样：自提汉防己甲素、汉防己乙素的乙醇溶液，汉防己甲素、汉防己乙素对照样品乙醇溶液。

展开剂：①氯仿-乙醇（10:1）②甲苯-丙酮-乙醇（4:5:1）③氯仿-丙酮-甲醇（4:5:1）

展开方式：上行法，在层析缸里放一小杯氨水，饱和15min.

    显色：喷改良碘化铋钾试剂。

注：特别强调氨水饱和的原理，因为是硅胶展板，硅胶是酸性，需要展开的是碱性化合物，因而板子需要事先饱和。

（2）轮环藤酚碱的色谱条件

    薄层板：硅胶G-CMC-Na板。

    点样：自提轮环藤酚碱乙醇溶液，轮环藤酚碱的对照品乙醇溶液。

    展开剂：甲醇-氨水（7:3）

    显色：喷改良碘化铋钾试剂。

注：轮环藤酚碱分离取消，这一步不做

2.5 附注

1.提取总生物碱时，回收乙醇至稀浸膏状即可，过干时，当加入1%盐酸后会结成胶装团块，影响提取效果。

2.酸水液用二氯甲烷洗涤，是为了去除非碱性脂溶性杂质。PH=2时，生物碱全部成盐，一般不被二氯甲烷提取。

3.用1%氢氧化钠溶液洗二氯甲烷液目的是分离酚性生物碱。汉防己乙素结构中的酚羟基由于空间效应和氢键形成，呈阴性酚羟基性质，酸性减弱，不溶于强碱溶液中，在此步骤中仍留在二氯甲烷中。

4.氧化铝柱净化可选用1cm×20cm，氧化铝用量约5g，采用干法装柱。

注：用湿法上柱子，快。

2.6 思考题

1.汉防己甲素、汉防己乙素在结构上性质上有何异同？实验过程中，我们应该怎样利用它们的共性和个性？怎样分离？请设计方案。

2.分离水溶性和脂溶性生物碱的常用方法有哪些？

3.萃取过程中怎样防止和消除乳化？