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作者：

徐东宝

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摘要：

第一部分:模型建立及验证 目的:1.采用弹力蛋白酶(elastase,EA)诱导法建立一种能够用于新型介入材料研究的兔颈动脉瘤模型;2.行血管内介入造影(DSA)检查用于兔颈动脉瘤模型成瘤率的验证,确认兔颈动脉瘤模型采用此方法建立的可行性. 方法:1.选择由第四军医大学动物实验饲养中心提供的健康成年40只新西兰大白兔,体重约3～4kg左右,雌雄各半.随机分为4组,A组(对照组);B组(2周组);C组(3周组);D组(4周组),对照组,实验组每组10只新西兰大白兔饲养方法条件一致.2.实验组B组,C组,D组麻醉后采用外科手术方法,于显微镜下小心分离暴露新西兰大白兔右侧颈总动脉起始段,用显微镊仔细小心地剥离血管外膜表面的纤维结缔组织,用游标卡尺比对在距离兔右侧颈总动脉起始端约2.0cm处2-0手术丝线结扎颈总动脉,使用显微外科血管夹小心轻柔夹闭右侧颈总动脉起始端,注意保护迷走神经不要误夹以致损伤,在右侧颈总动脉起始端形成一密闭管腔,于密闭管腔末端使用针头带有细长软管的1ml注射器吸取含肝素钠的生理盐水多次反复冲洗密闭管腔至无血水残留,于密闭管腔内小心注射预先配置好的0.1ml含70U的弹力蛋白酶溶液,并同时用2-0手术丝线结扎管腔末端保持密闭管腔充盈膨胀,血管及周围组织滴注生理盐水保持湿润,20分钟后松开右侧颈总动脉起始端显微外科血管夹.对照组手术方法及过程同实验组,只是对照组在密闭管腔内注射的弹力蛋白酶变替换为生理盐水.3.术后各组动物模型均在各自设定的时间段给予行经股动脉穿刺的兔颈动脉瘤血管造影术(DSA),通过影像学直接地观察动脉瘤的大小,形态与载瘤动脉的关系,根据动脉瘤内血流是否通畅判断成瘤率,验证此方法建立的兔颈动脉瘤模型是否成功. 结果:模型建立2周后,对照组存活7只兔子(因为此组最先做,易麻醉过量致死),实验组存活27只兔子.经血管造影(DSA)观察到对照组兔右侧颈总动脉血管起始端形成一长约0.3～1.5cm左右的盲端,正常颈总动脉血管的生理解剖结构及形态走形消失.实验组存活27只兔子(3只因肺部感染死亡),实验组采用弹力蛋白酶诱导法建立兔颈动脉瘤模型中,6只动脉瘤闭塞;21只模型成功建立,其动脉瘤高约0.3~1.3cm之间,瘤颈宽度在0.3~1.2cm之间.实验组总的成瘤率在80%左右,实验组各组间成瘤率比较无明显差别(P>0.05). 结论:采用弹力蛋白酶诱导法,能够在较短时间内成功建立理想兔颈动脉瘤模型,该模型制作方法简单,模型存活时间长,能够顺利地应用于动脉瘤的介入栓塞治疗及后期研究;血管内介入造影术(DSA)能够准确的验证弹力蛋白酶诱导法建立的动脉瘤模型是否成功,是检验动脉瘤的金标准,是后期动脉瘤模型用于新型材料介入治疗及效果评价的首选必备方法. 第二部分:VEGF,TGF-β在模型中的表达情况及机制的探究 目的:1.采用常规HE染色方法观察兔颈动脉瘤模型动脉瘤壁的组织病理学变化及瘤壁结构的重塑;2.采用免疫组织化学的方法检测血管内皮生长因子(VEGF),血管转化生长因子(TGF-β)在弹力蛋白酶诱导法建立的兔颈动脉瘤模型动脉瘤壁中的表达,研究,探讨VEGF,TGF-β在动脉瘤壁发生血管壁重塑过程的作用及相关性,探讨动脉瘤发生的机制. 方法:1.在各实验组相应时间段2周,3周,4周,采用外科手术法,于显微镜下分离充分暴露各实验组动物模型的右侧颈部动脉瘤,观察动脉瘤的生长情况,并使用游标卡尺,圆规测量动脉瘤的大小(瘤高度,颈宽度,瘤宽度)等,并取该实验组各组动物模型的动脉瘤,组织包埋,冰冻切片机刀片平行于原颈总动脉血管横截面进行切片,冰冻切片保存足够数量标本(用于HE染色,免疫组织化学染色),经HE染色处理动脉瘤瘤壁,使用高倍光学摄像显微镜观察弹力蛋白酶诱导法建立的实验组B,C,D各组动脉瘤模型瘤壁的组织病理学变化及瘤壁的结构重塑.同样,采用外科手术法取下对照组A组右侧颈总动脉部盲端血管,观察盲端的生长情况,有无血栓形成.并使用游标卡尺精确测量右侧颈总动脉盲端血管的长度,直径,取下盲端血管,组织包埋,采用冰冻切片方法,冰冻切片机刀片平行于颈总动脉血管横截面进行切片,经HE染色处理盲端血管管壁.观察比较对照组A组兔颈部血管与实验组动脉瘤血管的变化及验证实验组兔颈动脉瘤模型成功建立的可行性.2.选择对照组模型的血管标本和各实验组2周,3周,4周的模型动脉瘤标本,既使用上述准备的冰冻切片标本经免疫组织化学染色法检测VEGF,TGF-β在弹力蛋白酶诱导法建立的兔颈动脉瘤模型动脉瘤壁中的表达. 结果:1.HE染色结果:经高倍光学摄像显微镜观察到对照组A组血管管壁结构无明显变化,管腔无扩大或缩小,血管的各层结构清晰可见,中层弹力层正常结构存在,弹力层无断裂,连续性完整,平滑肌细胞数量无明显增多或减少,大小无改变,呈环形排列整齐,厚度均匀一致,管壁无重塑.实验组动脉瘤模型动脉瘤管腔扩大,动脉瘤内膜,瘤壁变薄,血管弹力层减少或消失,中层平滑肌细胞排列紊乱,经弹力蛋白酶作用细胞溶解数量减少,血管正常管壁结构消失;2.使用免疫组化法验证VEGF,TGF-β在弹力蛋白酶诱导法建立的兔颈动脉瘤模型动脉瘤壁中的表达,可见VEGF,TGF-β在对照组中无表达或少量表达,在实验组21只成功建立的动脉瘤的模型中,VEGF在动脉瘤模型中的阳性表达于2周左右达到高峰,之后表达强弱处于稳定状态无明显变化,实验组B,C,D各组动脉瘤瘤壁中VEGF的表达率明显高于对照组(P﹤0.05);TGF阳性表达3周左右达到高峰,TGF-β的表达2周至3周呈递增趋势,3周至4周表达呈递减趋势,实验组B,C,D各组动脉瘤瘤壁中TGF-β的表达率明显高于对照组A组(P﹤0.05). 结论:1.兔颈动脉瘤模型瘤壁与人颅内自发形成的动脉瘤在瘤壁组织病理生理学变化及其管壁结构重塑方面相类似.2.实验组各组兔颈动脉瘤模型瘤壁中VEGF,TGF-β的表达明显增加.VEGF在动脉瘤模型的形成过程中,参与瘤壁的炎症反应,具有促进内膜修复,新生血管形成的作用;TGF-β不仅直接作用于管壁全层参与了动物模型瘤壁的炎症反应,血管壁重塑,而且对VEGF的表达起着一定的调控作用.

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关键词：

弹力蛋白酶 兔颈动脉瘤模型 DSA HE染色 VEGF TGF-β

被引量：

1