革兰氏阴性细菌是一类在革兰氏染色反应中呈红色的细菌，由于包含的双层膜和周质空间的复杂结构，使其蛋白分泌需要跨越内膜(inner membrane，IM)和外膜(outer membrane，OM)两层膜，较革兰氏阳性细菌困难，为此革兰氏阴性细菌进化出多种蛋白分泌系统[1]。大肠杆菌作为最常用的工程菌被广泛应用于生物药品和化学品的生产中，如重组人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子、地尼白介素、苯甲醇、戊二烯、肉桂醛和富马酸[1-2]等。

本课题组在前期分离得到一株Escherichia coli ZH-4，该菌具有分泌胞外纤维素酶的能力，这是实验室标准菌株不具备的；通过提取周质空间和发酵液中的蛋白进行SDS-PAGE电泳，发现在周质空间和发酵液中均有该蛋白存在；初步认定该酶的分泌属于两步分泌途径，进而敲除Sec和TAT分泌系统中的关键基因，发现该酶的分泌未受到影响，由此证实该菌的蛋白分泌途径可能归属一个全新的分泌系统或存在一些未知转运蛋白的参与，这进一步说明革兰氏阴性细菌蛋白分泌系统有许多方面尚属未知[3-4]。大肠杆菌作为革兰氏阴性细菌中典型的模式菌株，是工业生产中最常用的细胞工厂，可以生产大量基因工程药物和高附加值蛋白质产物。因此，探索其蛋白分泌机制的意义较大，未来在工业应用上前景光明。本文旨在归纳总结革兰氏阴性细菌现有的蛋白分泌系统，以期为蛋白分泌机制的研究提供参考。

随着研究的逐渐深入，革兰氏阴性细菌的多种分泌途径不断被发现。其中大肠杆菌的分泌系统研究最多，迄今已有九大分泌系统被发现，即Ⅰ-Ⅸ型分泌系统[5]，但由于Ⅶ型和Ⅷ型并未得到广泛的认可，因此很多学者把这2种分泌类型都归类到Ⅴ型分泌系统中。在以上分泌系统中，分泌蛋白的转运一般有2种途径：(1) 分泌蛋白首先穿过质膜转运到周质空间，然后通过细胞膜分泌到胞外，这个过程蛋白的分泌经过2次跨膜，因此被称为两步分泌过程，大肠杆菌中属于这一分泌过程的系统有Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅶ型、Ⅷ型和Ⅸ型；(2) 分泌蛋白通过形成的连续通道从细胞质直接转运到胞外，不经过周质空间这一中间场所的停留和积累[6-7]，大肠杆菌的Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅵ型分泌系统属于一步分泌过程[8]。图 1展示了革兰氏阴性细菌Ⅰ-Ⅵ型分泌系统的分泌机制[9]。

已有研究表明，分泌蛋白的运输通常由信号肽参与介导，信号肽(signal peptide，SP)也被称为信号序列，是一种可对膜蛋白、分泌蛋白和溶酶体蛋白进行定位的标签，一般由15–30个氨基酸残基构成，通常位于蛋白质的氨基端(N端)，也有一部分位于蛋白质的羧基端(C端)[10]。信号肽一般无保守的氨基酸序列，但是有保守的结构特征。在结构上由3个区域构成：(1) 带正电荷的氨基末端，也称为碱性氨基末端(n区)；(2) 中间的疏水核心，信号肽的主要功能区(h区)；(3) 带负电荷的羧基末端，是信号序列的切割位点，也称加工区(c区)[11-15] (图 2)。信号肽广泛地存在于原核生物和真核生物中，枯草芽孢杆菌已鉴定的胞外分泌蛋白中有50%的蛋白存在典型的信号肽，大肠杆菌的胞外蛋白分泌有90%以上依赖于信号肽，真核生物中有20%的分泌蛋白存在信号肽[15]。典型的信号肽序列长度一般为25–30个氨基酸残基，但是真核生物中存在的信号肽普遍更长，可高达140个氨基酸残基。革兰氏阳性细菌结构简单，蛋白的分泌相对容易，因此信号肽的数量和类型也较少，一般以典型的序列形式存在，而革兰氏阴性细菌相比革兰氏阳性细菌在结构上更加复杂，由于两层膜的结构使其在蛋白分泌上更加困难，所以其分泌蛋白的信号肽在类型和数量上相对较多[16]。在蛋白分泌的过程中，分泌蛋白携带的信号肽被转运蛋白识别，进而靶向对应的分泌系统帮助其转运到胞外，因此该结构是实现蛋白高效分泌的关键因素。

绝大多数分泌蛋白的氨基末端(N端)携带信号肽序列，在分泌蛋白转运的过程中，通过识别信号肽从而定位到相对应的转运通道运输到膜外。双精氨酸转运酶途径是典型的通过识别携带保守序列的N端信号肽来完成跨内膜转运的分泌系统[17]，通过该途径分泌的底物有核糖体结合蛋白、碱性磷酸酶和绿色荧光蛋白等。Koike等[18]的研究中提到一种分泌蛋白(autotaxin)，发现其N末端疏水序列起到信号肽的作用，在跨膜后被信号肽酶切割。Souza等[19]的研究报道了鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)中针状亚基蛋白YscF的分泌，证实了该蛋白包含N末端分泌信号，而且功能性N末端信号肽是YscF分泌所必需的。由于信号肽会以不可预测的方式影响蛋白的合成和分泌，通常以大肠杆菌作为受体菌来表达和分泌重组蛋白，采用的方法便是对N端信号肽进行改造，以此来改善重组蛋白的分泌[20]。对N端信号肽的研究可能会成为提高重组蛋白工业化产量的关键。

有一小部分分泌蛋白在其羧基末端(C端)携带信号肽序列，如Kulkarni等[21]研究发现有多种C端序列参与黄杆菌(Flavobacterium)的蛋白质分泌，其中提到牙龈蛋白酶RgpB的C末端13个氨基酸或2个氨基酸的缺失导致截短的蛋白质在周质中积累，并且在氨基酸732处保守的赖氨酸转化为丙氨酸也导致分泌减少，这一现象说明C端携带信号肽介导分泌，信号肽的缺失或不完整会导致分泌过程无法正常进行。Izadi-Pruneyre等[22]发现一株革兰氏阴性粘质沙雷氏菌(Serratia)在缺铁的情况下分泌一种血红素结合蛋白HasA，其胞外转运过程依赖于C末端的分泌信号。Vergunst等[23]发现根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) VirB/D4的Ⅳ型分泌系统转运蛋白质中存在C末端转运信号序列，通过该分泌系统将效应蛋白转运到宿主细胞中。Nagai等[24]研究证实肺炎军团菌(Legionella pneumophila)中存在的Dot/Icm系统归属于细菌Ⅳ型分泌系统，其RalF蛋白是通过与Dot/Icm系统结合并转运到宿主细胞中，同时证实了RalF蛋白C末端信号肽的识别是发生易位的关键。C端信号肽与N端信号肽可以共同存在并分别介导不同的跨膜运输。经Ⅸ型分泌系统分泌的蛋白不仅可以允许通过Sec系统穿过细胞质膜输出的N端信号肽，而且还具有保守的C端结构域(C-terminal domain，CTD)，这些C端结构域被认为是引导蛋白靶向T9SS以穿过外膜分泌的关键[25]。因此，研究C端信号肽对实现蛋白高效分泌意义重大。

Ⅰ型分泌系统(type Ⅰ secretion system，T1SS)广泛存在于革兰氏阴性细菌中，该系统结构简单且依赖于含ATP结合盒的输出体。其主要有HlyB、HlyD和TolC这3种关键蛋白，这3种蛋白具有一定的协同作用，缺少任何一个蛋白都无法完成蛋白的胞外分泌[26]。大多数情况下，该系统分泌的蛋白通过识别C端存在的46-60个氨基酸残基的信号肽，以未折叠的状态通过一个由内膜ATP结合盒转运体、膜融合蛋白和外膜孔TolC组成的跨膜通道，实现底物蛋白的胞外运输，在胞外进行正确的折叠[27]，形成具有一定结构的蛋白，如图 1所示。该系统主要分泌多糖、脂蛋白、维生素B12、金属螯合物和多种小肽信号分子等。

Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system，T3SS)是一种多蛋白复合物，主要存在于革兰氏阴性病原菌中，负责转运毒力因子到宿主细胞中。该系统主要由3部分构成，即系统基体、横跨细胞内外膜的环状系统和中空的输出装置[28]。T3SS的复合物基体由多个环形成，即由2种寡聚蛋白质(EscD和EscJ)构成的2个同心内膜环和由单个寡聚蛋白质(EscC)构成的外环[29]，中空的输出装置由5种膜蛋白组成，分别为EscR、EscS、EscT、EscU和EscV[30-31]，环状系统主要由一些转运蛋白构成。T3SS是一步法分泌机制，该系统分泌的毒力蛋白通常以半折叠或未折叠的状态注入到真核细胞的细胞质内发挥其致病作用[32]。

Ⅳ型分泌系统(type Ⅳ secretion system，T4SS)是一种多功能运输系统，不仅可以通过接合及将效应分子输送到宿主细胞中来介导细菌间的DNA转移，如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori) Cag的T4SS转移CagA致机体致病，还可以转运毒素和效应蛋白，同时也在细菌耐药性的传播中起关键作用[33-34]。该系统广泛存在于革兰氏阴性细菌中，包含12种蛋白，即VirB1-VirB11和VirD4。这些蛋白质组装成内膜复合体(intimal membrane complex，IMC)、外膜核心复合体(outer membrane core complex，OMCC)和外毛3个相互连接的复合体，3种三磷酸腺苷酶(VirB4、VirB11和VirD4)负责为T4SS组装和底物转移提供能量；内膜复合体是由VirB3、VirB4、VirB6、VirB8和VirD4这5种蛋白构成，每个蛋白都存在多个拷贝，外膜核心复合体由VirB7、VirB9和VirB10及其各自的14个拷贝共同组成，并在周质中形成一个通道，VirB10形成外膜通道并连接外膜和内膜，转糖基酶VirB1通过破坏部分肽聚糖层促进系统插入周质空间[34-35]。

Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system，T6SS)是一种蛋白质的动态纳米机器，存在于许多革兰氏阴性菌中，主要负责将效应蛋白转移到靶细胞中[36]。该系统包含2种结构，即跨膜复合物结构和类似噬菌体的穿刺结构，由13个核心蛋白成分组成，分别为：膜蛋白TssL、TssM、TssJ和IcmF，脂蛋白SciN，溶血素调节蛋白Hcp、DotU/IcmH，能量蛋白ClpV，富含缬氨酸甘氨酸的蛋白质(VgrG)，管道蛋白VipA/VipB，以及与噬菌体基底相似的成分蛋白TssE，由这些蛋白组成的跨膜复合物结构的作用原理如图 1所示。其中，TssL、TssM和TssJ形成一个跨越内膜的复合物，尾鞘蛋白是由管道蛋白VipA/VipB包含Hcp管构成，VCA0109蛋白负责降解部分的肽聚糖层帮助蛋白转运，TssE蛋白存在于细胞质中，与其他核心蛋白协同系统正常转运[37-38]。效应蛋白的转运过程形似针头注射，溶血素调节蛋白Hcp和富含缬氨酸甘氨酸的蛋白质VgrG构成类似菌毛结构，刺穿靶细胞的磷脂双分子层，将效应蛋白注入到靶细胞中，使其发挥生物学功能[39]。

Ⅱ型分泌系统(type Ⅱ secretion system，T2SS)普遍存在于革兰氏阴性菌中，多数底物蛋白利用该系统完成胞外分泌，属于两步法，即底物蛋白先从胞质跨内膜分泌到周质空间再穿过外膜分泌到胞外。经该系统分泌的蛋白需识别N端的典型信号肽，跨内膜(Sec、Tat和SRP)后信号肽被切除，再通过一般分泌系统(GSP系统)分泌胞外。由该系统分泌的蛋白多为酶蛋白，如纤维素酶、果胶酶、磷脂酶、淀粉酶和核糖核酸酶等。

(1) SecB依赖途径

一般分泌(Sec)途径代表一种常见的机制，革兰氏阴性细菌通过该机制可以将黏附素、蛋白酶和毒力因子等多种蛋白质分泌到细胞质外环境中，而革兰氏阳性菌因为缺乏分子伴侣SecB蛋白，因此，Sec系统依赖与SecB类似的其他靶向蛋白。在革兰氏阴性菌中，该分泌途径的关键组分包括SecA、SecYEG、SecDF、YajC、YidC以及2种胞质外信号肽酶LspA和LepB[40]。SecA是一种膜结合蛋白，SecYEG是由3种蛋白构成的异源三聚体复合物，镶嵌于内膜中形成分泌通道，SecDF、YajC和YidC作为辅助蛋白在分泌过程中起到一定的调控作用[41-42]。信号肽酶LspA和LepB负责切除前蛋白上的信号序列，释放成熟的结构域，使其发生折叠，成熟的结构域保留在周质内，信号肽则被蛋白酶降解。Sec机制是一种跨内膜分泌途径，可以识别蛋白质。分泌蛋白在易位之前必须在细胞质中保持一种未展开的构象，以便能够通过SecYEG易位，因此大多数未折叠的多肽都是通过Sec转运[42]。SecB可以识别的功能信号序列一般由18–30个氨基酸构成，序列包含3个区域，即带正电荷的N端区域、含疏水性的H区域以及携带切割位点的C端区域[43]。该途径由分子伴侣SecB识别携带信号肽的底物蛋白，靶向膜结合蛋白SecA，再穿过由核心蛋白SecYEG组成的膜孔通道运输到膜外，完成整个转运过程[44]，如图 3所示。革兰氏阳性细菌中也有与革兰氏阴性细菌相似的Sec系统，但存在更长的SPs、更多的信号肽酶以及额外的SecA2和SecY2拷贝，其系统组成的关键蛋白以同源物的形式发挥其功能，但也有部分菌株缺乏关键蛋白同源物以功能相似蛋白弥补，如枯草芽孢杆菌中缺乏SecB的同源物，使用其他靶向伴侣CsaA和SatS实现与大肠杆菌中SecB相似的功能来弥补该转运系统功能的缺失，促使系统的正常运转[45]。

(2) SRP途径

信号识别颗粒途径(SRP途径)是介导内膜蛋白(intimal membrane protein，IMP)靶向质膜的一种广泛机制，最早发现于真核生物中，直到1989年才在革兰氏阴性细菌的代表菌株大肠杆菌中发现由SRP54类似物(fifty-four-homology，Ffh)和4.5S RNA组成的SRP复合物，证实该途径在原核生物中也存在[46-49]。SRP途径的关键组分包括Ffh和4.5S RNA组成的SRP复合物、受体蛋白FtsY及SecYEG复合体。在整个分泌过程中，新生肽在核糖体上合成，与此同时，SRP复合物与其识别并结合，当SRP复合物与受体蛋白FtsY结合后，Ffh的GTPase活性催化GTP水解，SRP与受体FtsY解离，同时新生肽向SecYEG系统或YidC系统转运，在其他辅助因子的参与下运出质膜[50-52]，如图 3所示。真核生物的SRP由6种蛋白质和一个称为7SL RNA的RNA组成，根据分子量命名为SRP9、SRP14、SRP19、SRP54、SRP68和SRP72。编码7SL RNA的基因一共有3个，即RN7SL1、RN7SL2和RN7SL3，而古细菌中也有SRP的存在，由7S RNA和2种蛋白组成(SRP54和SRP19的同源物)[11-12]。

(3) Tat途径

Tat分泌系统(双精氨酸转运酶途径)是一类同Sec分泌系统平行运行的跨内膜途径，分泌蛋白的转运一般通过细菌的细胞质膜和植物叶绿体的类囊体膜，与Sec途径的主要区别在于：Sec分泌途径主要分泌的蛋白都处于未折叠状态，而Tat途径分泌的是具有折叠构象的底物蛋白[17, 53-56]。因此通过Tat途径分泌的蛋白较少。Tat分泌途径的组分类型取决于物种，以革兰氏阴性细菌大肠杆菌E. coli为例，其Tat系统主要由TatA、TatB和TatC 3种内膜蛋白构成，这3种蛋白由一个操纵子(TatABC)编码[54]。TatA是Tat系统的一个小型的动态亚单位，被界定为蛋白转运过程中的活性成分，TatB和TatC构成一个受体复合物[57]。通过Tat途径分泌的蛋白含有一段高度保守的信号序列(S-R-R-x-F-L-K)，当携带信号肽的蛋白与Tat受体复合物接触作用，导致TatA发生寡聚化形成寡聚物；TatA的寡聚物形成一种带盖的运输通道使底物蛋白运输到膜外[56-58]，如图 3所示。在革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌中也存在Tat分泌系统，与E. coli不同的是由2条平行的TatA-TatC途径组成，每条途径都有一个单独的TatA蛋白且基因组上存在TatC的2个拷贝，即TatCd和TatCy，TatCd和TatCy分别与TatA的2个拷贝(TatAd或TatAy)形成复合物促使其并行运行；TatE常作为一种候补蛋白，大肠杆菌TatE和枯草芽孢杆菌TatAd和TatAc能够有效地弥补大肠杆菌中TatA的缺乏，使系统继续发挥转运功能[56]。

Ⅴ型分泌系统(type Ⅴ secretion system，T5SS)是分泌系统六大类型中最简单的一种，主要分为3种类型，即自主转运系统(Va型或AT-1型)、双伴侣分泌系统(Vb型)和Vc型系统(AT-2)[60]。T5SS系统分泌底物蛋白跨内膜的转运至少存在2个途径：(1) 依赖于分子伴侣的SecB途径，通过识别蛋白的N端典型信号肽，将前体蛋白靶向SecA，进而从Sec分泌途径完成转运；(2) SRP途径，通过将前蛋白与核糖体-SRP复合物直接靶向进而发生共易位；通过内膜后信号肽被切除，成熟的蛋白质被释放到周质空间中，同时C端β-结构域插入外膜并形成转运通道，然后passenger结构域插入通道中并转运至表面以完成蛋白的跨外膜运输[61-62]。该系统可以分泌一些分子量较大的蛋白(100 kDa以上)。

随着对革兰氏阴性细菌研究的深入，人们也逐渐开始关注其蛋白分泌系统的研究，传统蛋白分泌系统的研究方法采用的是亚细胞定位技术。通过定位某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位，从而追踪其分泌途径，完成对整个路径的解析，但是尚存在纯化的蛋白容易被其他细胞器蛋白污染，以及针对参与分泌途径、胞吞和胞吐等高度动态过程中的蛋白质无法精确定位、定量和检测困难等问题，使得细胞内膜运输系统的研究与了解只是冰山一角。

随着技术应用的发展和新型研究技术的不断挖掘，一些新的研究方法被不断提出。Chen等[63]提出了一种新方法，该方法不仅可以有效分离和检测多个细胞器的蛋白组分，还可以检测和定位在不同亚细胞器和膜系统之间移动的蛋白质，克服了传统亚细胞定位技术存在的弊端，实现了大规模定性和定量分析亚细胞蛋白，进而准确解析分泌途径。除此之外，还有多种方法也被应用到蛋白分泌系统的研究中。表 1对部分方法进行比较，为下一步应用提供参考。

随着研究方法和检测技术的发展，新型的分泌系统不断被发现，有的已知系统也被重新认识，也会有一些已经熟知途径的未知机制被揭开。如Zhao等[47]的研究发现一种“替位候补”机制，通过抑制因子筛选发现大肠杆菌中的SRP并不是必需的，并在SRP缺陷株中发现2种翻译起始因子(infB、infC)和一种核糖体蛋白(rpsC)，它们参与了翻译的起始以弥补SRP缺失的机制。这项工作也为已知的分泌系统提供了一个新的方向，帮助研究者更好地去理解革兰氏阴性细菌的分泌机理。

本课题组前期研究发现，一些分子伴侣影响了酶蛋白的分泌，在E. coli JBZ-DH5α (基因组上更换组成型强启动子J23119和核糖体结合位点B0034实现了BcsZ的过表达)中，当分子伴侣基因ibpA、ibpB过表达时，纤维素酶的分泌显著增加[4]。也有其他相关研究证实分子伴侣对蛋白的分泌有影响，如Imamoglu等[78]的研究中提到依赖ATP的Hsp70伴侣蛋白(大肠杆菌中的DnaK)与J蛋白和核苷酸交换因子(分别为大肠杆菌DnaJ和GrpE)协同介导蛋白质折叠，它们作为分子伴侣在蛋白的分泌过程中发挥着重要的作用。大肠杆菌中研究最多的分子伴侣DnaK、DnaJ、GrpE、GroEL、GroES负责底物蛋白结合，防止其发生错误的折叠，帮助折叠成天然状态。不仅如此，这些分子伴侣对底物蛋白还有一定的选择性，这样可以实现蛋白的高效折叠并帮助分泌[79-81]。最为典型的Sec分泌途径中的SecB蛋白就是一种分子伴侣，其帮助蛋白底物靶向SecA从而帮助分泌胞外。课题组前期为革兰氏阴性细菌蛋白分泌机制的研究提供了一种全新的材料[82]，研究发现的分子伴侣是如何参与酶蛋白分泌的机制还需进一步去证实。