背景技术：

2.阿尔兹海默病(alzheimer's disease，ad)，又称老年痴呆，属于神经退行性疾病。目前无明确的成因，前期起病隐匿，不容易受到大家的关注，后期病情加重且整个进程缓慢。临床表现为认知和记忆功能障碍，日常生活能力进行性减退和行为障碍，最终导致死亡，目前尚无有效的防治方法。ad现为发达国家第6大死因，随着世界人口老龄化的加剧,患病人数逐渐增多，预计到2050年全球阿尔茨海默症患者人群将以每20年递增一倍的速度增长至1.52亿，成为全球范围内的最主要医学和社会问题之一，将对社会和人类经济发展造成巨大的负面影响。3.阿尔兹海默病患者的照料和治疗花费巨大，除近年fda批准上市的抗 aβ42单克隆抗体之外，尚无药物可以改变或者延缓阿尔茨海默病的病理进程，只能在一定程度上减轻病人的痛苦，改善一些记忆力衰退等症状。虽然世界各国投入了大量的资金用于研发治疗阿尔兹海默病的药物，但绝大多数药物在临床试验阶段失败，上市药物的疗效亦不十分显著。针对这种现状，亟须针对阿尔兹海默病的主要病理过程研发新型药物。4.ad的主要病理特征是脑内的aβ42聚集形成斑块。由淀粉样前体蛋白 app通过β、γ分泌酶水解产生，其中aβ42积累后会损伤突触并使得认知功能下降；因此抑制aβ42聚集的化合物将可能成为防治ad的潜在药物。根据我们的分析，aβ42的聚集过程是系统自由能降低的自发过程，包括以下几个步骤：首先， aβ42单体疏水性聚集成寡聚体，成为聚集核心；第二，寡聚体不断延伸成为aβ42纤维；第三、纤维聚集成为纤维束；第四，纤维束沉积形成斑块。本发明，利用我们构建的由20种l-α-氨基酸组成的二肽结构数据库，以aβ42五元寡聚体蛋白质结构(聚集核心)为靶标，通过分子对接、分子动力学分析和分子药理学实验，研制出一种由8种二肽类化合物(组氨酸-精氨酸(hr)、组氨酸-色氨酸(hw)、精氨酸-苯丙氨酸(rf)、精氨酸-精氨酸(rr)、精氨酸-色氨酸(rw)、精氨酸ꢀ‑酪氨酸(ry)、色氨酸-精氨酸(wr)以及精氨酸-甲硫氨酸(rm))构成的复方混合物，可以与五元聚合态aβ42结合，从而抑制aβ42聚集过程，并降低aβ42的细胞毒性。相较于其他物质，小分子肽类化合物与靶蛋白相互作用遵从蛋白质与蛋白质相互作用原理，并且容易透过血脑屏障，此外还具有良好的生物相容性、毒副作用低等优点。

技术实现要素：

5.1.发明目的6.研发一种具有抑制aβ42聚集作用，降低aβ42的细胞毒性的二肽化合物及其复方混合物。7.2.发明的技术方案8.一、利用python语言编写chemscript脚本，创建由20种l-α氨基酸组成的所有二肽的结构数据库。9.二、从蛋白质数据库(pdb)中筛选得到五元寡聚体aβ42(编号5oqv) 的蛋白质分子结构为靶蛋白构象。10.三、以五元寡聚体aβ42为靶蛋白，利用开源软件autodock和我们构建好的二肽结构数据库进行分子对接筛选出具备最佳对接状态的二肽。11.四、利用gromacs分子动力学软件，分析五元聚合态aβ42(5oqv) 与对接筛选出的8种二肽(hr、hw、rf、rr、rw、ry、wr和rm)的结合稳定性(利用二肽分子结构中重元素的均方根偏差rmsd来衡量)。12.五、利用gromacs分子动力学软件，分析对接筛选出的8种二肽与五元聚合态aβ42(5oqv)的相互作用能(由兰纳-琼斯势能和静电库仑势能构成)。13.六、药理学实验分析8种二肽及其复方混合物抑制aβ42聚集，并降低aβ42引起的细胞毒作用。14.3.发明的效果15.本发明首次利用python语言构建了二肽数据库，通过分子对接筛选出可以与aβ42在不同位置结合的8种二肽，并利用分子动力学方法分析8种二肽(hr、hw、rf、rr、rw、ry、wr和rm)与aβ42蛋白的相互作用，与传统的研究方法相比，大大节约了人力物力，提高了工作效率。在此基础上，设计实施药理学实验，并验证这8种二肽类化合物及其复方混合物对aβ42聚集有很好的抑制作用，减轻了分泌表达的aβ42对sh-sy5y神经细胞株的细胞毒作用。依据ad 发病机理，由这8种二肽类化合物构成的复方混合物用于药物或食品，可以改变 aβ42聚集及其引起的细胞毒作用等病理过程。附图说明16.图1.aβ42聚集并在脑内沉积的过程。17.图2.分子对接得到的八种二肽类化合物的化学机构。hr：组氨酸-精氨酸；hw：组氨酸-色氨酸(hw)；rf：精氨酸-苯丙氨酸；rr：精氨酸-精氨酸； rw：精氨酸-色氨酸；ry：精氨酸-酪氨酸；wr：色氨酸-精氨酸；rm：精氨酸ꢀ‑甲硫氨酸。18.图3.分子对接得到的8二肽与五元聚合态aβ42的结合示意图。条带样结构代表五元聚合态aβ42的空间构象。hr：组氨酸-精氨酸；hw：组氨酸-色氨酸(hw)；rf：精氨酸-苯丙氨酸；rr：精氨酸-精氨酸；rw：精氨酸-色氨酸；ry：精氨酸-酪氨酸；wr：色氨酸-精氨酸；rm：精氨酸-甲硫氨酸。19.图4.分子动力学分析8种二肽类化合物的与五元聚合态aβ42结合的稳定性。rmsd：均方根偏差，代表二肽化学结构中重元素的空间位置变化程度。 hr：组氨酸-精氨酸；hw：组氨酸-色氨酸(hw)；rf：精氨酸-苯丙氨酸；rr：精氨酸-精氨酸；rw：精氨酸-色氨酸；ry：精氨酸-酪氨酸；wr：色氨酸-精氨酸；rm：精氨酸-甲硫氨酸。20.图5.分子动力学分析8种二肽类化合物的与五元聚合态aβ42的相互作用能。相互作用能为兰纳-琼斯势能和静电库仑势能之和，数值越负则表示相互之间的吸引力越大。hr：组氨酸-精氨酸；hw：组氨酸-色氨酸(hw)；rf：精氨酸-苯丙氨酸；rr：精氨酸-精氨酸；rw：精氨酸-色氨酸；ry：精氨酸-酪氨酸；wr：色氨酸-精氨酸；rm：精氨酸-甲硫氨酸。21.图6.药理学实验分析8种二肽类化合物及其复方混合物抑制aβ42聚集并降低aβ42细胞毒性的作用。a：8种二肽类化合物及其复方混合物抑制aβ42聚集的作用。aβ对照组：只有aβ42，未加入任何二肽化合物的对照组；hr、 hw、rf、rr、rw、ry、wr、rm或复方组为在aβ对照组基础上加入不同二肽化合物或者包括以上8种二肽的复方混合物的实验组。b：8种二肽类化合物及其复方混合物降低aβ42引起的细胞毒性作用。aβ对照组：只有分泌表达的 aβ42，未加入任何二肽化合物的对照组；hr、hw、rf、rr、rw、ry、wr、 rm或复方组为在aβ对照组基础上加入不同二肽化合物或者包括以上8种二肽的复方混合物的实验组。hr：组氨酸-精氨酸；hw：组氨酸-色氨酸(hw)；rf：精氨酸-苯丙氨酸；rr：精氨酸-精氨酸；rw：精氨酸-色氨酸；ry：精氨酸-酪氨酸；wr：色氨酸-精氨酸；rm：精氨酸-甲硫氨酸。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，与aβ对照组比较，统计学方法为单因素方差分析，并以fisher检验分析两组间的统计学显著性差异。具体实施方式22.以下结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明，按以下步骤进行：23.具体实施方式一、采用信息科学技术分析二肽类化合物与五元聚合态 aβ42的相互作用的方法。24.步骤一、二肽类化合物结构数据库的构建。用python语言编写chemscript脚本，建立由20种l-α-氨基酸随机组合构成的全部二肽类化合物结构的sdf(structure data file)格式的数据库。25.步骤二、检索美国结构生物信息学研究合作组织(rcsb)的蛋白质结构数据库(protein data bank，pdb)，下载聚合态aβ42(编号5oqv)的三维结构数据。下载下来的结构文件中，包含三元和五元聚合态aβ42结构。删除三元符合态结构数据，保留5元聚合态aβ42的结构数据，重新命名为5oqvpentamer.pdb 并保存，作为分子对接用的靶蛋白结构文件。26.步骤三、利用分子对接开源软件autodock，以5oqvpentamer为对接受体，用上述步骤一中构建的二肽类化合物结构数据库进行分子对接。对接结果依据经过优化的结合能进行排序，选取对接状态最佳的8种二肽类化合物，用于后续的分子动力学和药理学分析。27.分子对接筛选出的8种二肽类化合物，分别为hr、hw、rf、rr、rw、 ry、wr和rm，化学结构如附图2所示。28.步骤四、分子动力学分析8种二肽类化合物与aβ42结合的稳定性与相互作用能。gromacs分子动力学分析软件(2020.03版)安装于ubuntu(18.04 版)linux操作系统上，采用cuda(compute unified device architecture)支持的gpu混合并行运算模式，利用针对蛋白质结构从头计算加以优化的 amber99sb力场和tip3p明确水分子模型，分析8种二肽类化合物与aβ42结合的稳定性与相互作用能。系统单元定义为周期性边界与aβ42的最近距离为3.5 nm的正十二面体盒子。向系统单元中填充水分子，再用na+和cl-随机替换水分子使系统呈电中性。系统能量最小化，温度以及压力分别平衡后，进行分子动力学运算分析，计算与aβ42结合的二肽分子结构中除氢原子以外的重元素位置变动的均方根偏差(rmsd)(图4)；以及aβ42与二肽分子之间的兰纳-琼斯势能和库伦势能(静电力)。二肽分子中重元素位置变动rmsd值反映出二肽分子与 aβ42结合的稳定性；兰纳-琼斯势能与库伦势能之和为相互作用能(图5)，数值越负，代表相互之间引力越强。29.分析结果表明，hw及rr与aβ42的结合最为稳定。其它6种二肽与aβ42结合的rmsd值，经过短暂时间后亦可保持稳定状态(图5)。30.具体实施方式二、利用tht检测二肽化合物及其复方混合物抑制aβ42聚集的作用。aβ42采用β-片层构象相互聚集，产生三个疏水区，将疏水性氨基酸埋藏在蛋白质复合物的内侧，从而使系统自由能降低。tht是一种常用来聚集状态aβ42的苯并噻唑荧光染料，它可以专一性地结合到aβ42的β-片层结构，结合后tht的荧光增强。体系中aβ42的聚合态β片层结构越多，则体系的荧光强度就越强。tht结合在aβ42聚合态纤维外侧，不干扰aβ42聚集，因此，tht常用于分析判断aβ42聚合态纤维的形成。31.步骤一、aβ42以及二肽样品处理。aβ42粉末用1.0％nh4oh溶解为1mm 储备液。二肽化合物固体粉末使用10mm的磷酸盐缓冲液(ph 7.4)(pbs)溶解为1mm储备液。在后续实验中，所有储备液均在临用前用10mm pbs稀释为不同浓度的工作液。32.步骤二、利用硫磺素t(tht)，荧光检测二肽化合物及其复方混合物对 aβ42聚集的抑制作用。将0.0128mgtht粉末溶解于pbs，充分搅拌使其溶解，定容到10ml，制得4mm tht储备液。在黑壁透明底的96孔板中，依次添加终浓度为10μm的aβ42、8μm的二肽化合物或二肽复方混合物(每种二肽各1 μm)以及16μm的tht，反应总体积为125μl，每组设置5个重复。样品混合均匀后，37℃温育24小时。温育结束后，放入synergy h1酶标仪，设置激发波长450nm，在波长485nm检测荧光强度，结果如图6a所示。33.具体实施方式三、利用mtt化合物，分析二肽化合物及其复方混合物降低人神经母细胞瘤细胞株sh-sy5y分泌表达的aβ42的细胞毒作用。sh-sy5y 细胞株在转染了分泌表达aβ42(n末端加有分泌信号肽)的pcdna3.1质粒4小时后，按照细胞数5x103分入96孔板各孔中。实验组加入终浓度为8μm的二肽化合物或其复方混合物(每种二肽各1μm)，以未转染aβ42表达质粒的细胞未空白对照组，未加二肽化合物的细胞为aβ对照组。在37℃，5％co2培养箱中培养48h后，吸除培养基，向每孔中加入90μl无血清培养基和10μl mtt溶液(5mg/ml)，4小时后，吸除各孔溶液，加入100μl dmso，37℃摇床振摇 10min，在synergy h1酶标仪中，波长570nm处检测各孔吸光度值，以空白对照组平均值为100％基准值，折算各孔细胞活力(图6b)。