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作者：

曾志薇

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摘要：

猪δ冠状病毒病是一种由猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronaviru,PDCoV)引起的以引起哺乳仔猪腹泻为主要临床症状的一种肠道性接触性传染病.PDCoV可以感染不同年龄阶段的猪,并表现出与PEDV相似的临床症状和病理变化,其临床症状主要表现为仔猪腹泻,脱水,呕吐,死亡等;组织学变化则以萎缩性肠炎,小肠绒毛脱落,肠上皮空泡化等为主.PDCoV的广泛流行与传播,制约了养猪业的发展.而PDCoV发现时间较晚,因而针对该病毒的细胞传代培养及其对仔猪致病性的相关研究也相对缺乏.本研究采集广东地区发病猪场的腹泻病料,进行PDCoV的分离鉴定,以了解其体外培养特性以及对新生仔猪的致病性.采集自广东省惠州某发病猪场采集腹泻仔猪的粪便及小肠组织样本,经RT-PCR方法检测,结果为PDCoV阳性.将PDCoV阳性样品经处理后接种LLC-PK细胞并进行病毒的分离培养,连续传代至F16代后,病毒接种细胞开始出现细胞融合及形成多核体细胞等细胞病变.对于各代细胞培养液进行RT-PCR检测,结果均仅表现为PDCoV阳性,且没有检测出其他病原,测序结果也证实其为PDCoV,最终将此分离毒株命名为PDCoV HZ-01株.通过扩增HZ-01的S基因,N基因及M基因序列,并将其与其他PDCoV毒株进行同源性分析后发现HZ-01毒株与国内毒株CHN-HN-2014株的同源性最高(99.7%),与泰国毒株S5015L-2015及S5011-2015毒株同源性最低(95.9%),与美国国内毒株同源性约为97.9%～98.1%,与国内大部分毒株同源性均保持在97.4%～99.7%.为进一步研究所分离的PDCoV HZ-01毒株对仔猪的致病性,我们选取12头1日龄健康且未摄取初乳仔猪进行动物致病性试验,同时选取PEDV感染组作为参照,分别进行仔猪的感染试验.通过口服方式对仔猪进行感染,PDCoV感染剂量为:10~(4.86)TCID_(50)/m L×4 m L;PEDV感染剂量为:10~(4.5)TCID_(50)/m L×4 m L/头.实验结果显示:感染前仔猪精神状态,采食及外观均正常;感染后2天,PDCoV感染组仔猪开始出现轻微的腹泻症状,但未发展为持续性水样腹泻,且仔猪最终逐渐康复;而PEDV P2(病毒传代代次为2)感染组仔猪开始出现典型水样腹泻症状,且最终全部因持续性水样腹泻死亡.在临床症状方面,PDCoV感染组仔猪体重,采食量下降程度轻微,采食后仅出现轻微呕吐症状,体重增长缓慢;而PEDV组仔猪在感染后因持续性水样腹泻而导致仔猪体重急剧下降,感染后采食量也明显下降,且采食后仔猪出现严重呕吐症状.剖检仔猪发现PDCoV感染组仔猪与空白组仔猪相比肠管胀气严重,肠壁充血肿胀,而PEDV感染组仔猪肠壁明显变薄且通透,肠管胀气严重且肠内容物清晰可见.采集仔猪肠道制作病理切片并观察,发现PDCoV感染组仔猪肠道病变主要表现为轻微的肠绒毛萎缩,脱落,部分肠细胞死亡等病理变化.而PEDV感染组仔猪在感染后肠道出现重度肠绒毛萎缩,脱落,肠细胞大量死亡且肠上皮细胞严重空泡化.采集各组仔猪脏器及肛拭子进行RT-PCR检测后发现,PDCoV感染组仔猪感染后第3d,第4d及第8d均可在心,肝,脾,肺,胃,肠系膜淋巴结,肠等组织内均能检测到PDCoV,而PEDV感染组仔猪仅能在肠道内检测到该病毒的存在,且PDCoV感染组仔猪在感染后8天仍能在肛拭子内检测到病毒的存在.本研究从发病猪场的腹泻病料中分离得到PDCoV HZ-01毒株,了解了其体外培养特性;通过对其基因序列的比对,分析,了解其遗传进化规律.通过对仔猪的致病性实验,则进一步了解PDCoV的发病规律,为临床PDCoV的防治与诊断提供了理论依据.

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