稀土元素已经被广泛的应用于很多重要的领域, 尤其是在医药领域的应用越来越活跃, 近年来, 已经发现了稀土金属元素对黑色素瘤B16、宫颈癌细胞Hela、肝癌细胞HepG-2和PAMC82等肿瘤细胞的生长都有一定的抑制作用[1, 2], 人们已开始把金属离子与具有特殊药效的化合物进行结合, 研究得到了很多更有效的药物供临床应用, 这种方法被认为是发现、研究新型药物的一条很重要的途径[3]。

含支链的几种氨基酸已经广泛的应用于各种产业, 缬氨酸就是其中之一, 缬氨酸已经被应用于医药、化妆品和食品添加剂等方面[4, 5, 6, 7], 目前利用生物技术处理的方法生产氨基酸是最有效的。 存在于烤烟烟叶、烟气、白肋烟烟叶中的L-缬氨酸(L-Val, L-2-氨基-3甲基丁酸)是人体中一种非极性的必需氨基酸, 白色结晶性粉末, 可溶于水, 在乙醇、乙醚和丙酮中几乎不溶。 医药上用作氨基酸输液成分及合成新药等。 稀土与氨基酸所形成的配合物往往具有杀菌、消毒、抗凝血和降血糖等作用。

全反式维甲酸(ATRA)有一定的维持生长和分化的能力。 ATRA能诱导畸胎癌干细胞、骨髓白血病细胞和成纤维细胞癌细胞的分化, 基因表达诱导在分化过程进行, 基因的诱导极有可能是分化过程的基础。 其主要用于治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL), 作为一种抗肿瘤剂, 维甲酸还成功地用于食道癌、结肠癌、膀胱和乳腺肿瘤等肿瘤的治疗, 尤其对肝癌的治疗具有良好的前景。 然而, 有所不足的是, 维甲酸类的药物毒副作用较大。

本文报道了稀土(RE:Nd3+、Eu3+、La3+、Sc3+)-全反式维甲酸-L-缬氨酸4种新型的稀土配合物, 对所形成的配合物通过红外光谱、热重-差热法、元素分析、紫外光谱等进行了结构的表征, 并且利用MTT的方法对体外培养的人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549和人宫颈癌细胞Hela进行了抗肿瘤活性的测试。 结果表明, 配合物对3种癌细胞株生长的抑制作用, 也大体上随配合物浓度的增大而增强, 从总趋势来看, 配合物的抑制作用强于配体全反式维甲酸、L-缬氨酸和相应的金属硝酸盐。为了进一步阐明抗肿瘤作用的原因, 利用光谱方法和黏度法的手段, 对配合物与DNA之间的相互作用方式做了考察, 为进一步探索毒副作用小、高效、长效、较安全的抗肿瘤药物提供了一定的实验依据。

Scheme 1 Molecular structures of all-trans retinoic acid (A) and L-valine acid(B)

全反式维甲酸(ATRA, 郑州天健生物技术有限公司, Mr=300.44); L-缬氨酸(L-Val, 北京医药站, Mr=117.15); 稀土氧化物(RE2O3, 甘肃稀土公司); 1640培养液(Hyclone公司); PBS溶液(北京中杉公司); 胰蛋白酶溶液(Hyclone公司); MTT(CP, 鹏程生物); 小牛血清(calf serum, 杭州四季青生物工程材料有限公司); 无水乙醇(C2H5OH, 天津市富宇精细化工有限公司); 二甲基亚砜(DMSO, 天津市科密欧化学试剂有限公司)及其余试剂均为分析纯。

FTS-3000型傅里叶红外光谱仪(FT-IR, 日本岛津公司); 6300型热重-差热分析仪(TG/DTA, 美国PE公司); EL-Ⅲ 型元素分析仪(EL, Vario公司); LS-55型荧光分光光度计(美国PE公司); Agilent-8453型紫外分光光度计(美国Agilent公司); 力康/HF90型CO2细胞培养箱(, 上海力申科学仪器有限公司); Bio-Rad-570型酶标仪(日本Bio-Rad公司); 倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司); SW-CJ-2F型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司); 96孔细胞培养板(Costar3599, 美国Costar公司); 乌贝路德粘度计(天津玻璃仪器厂)。

1.2.1 配合物的合成 称取2 mmol全反式维甲酸, 加入圆底烧瓶中, 向其中加入15 mL无水乙醇, 调节水浴温度保持在60 ℃, 加热搅拌使其全部溶解, 依次向已溶解的溶液中先后逐滴加入1 mmol六水合稀土硝酸盐水溶液和1 mmol L-Val水溶液。待滴加完成后, 用浓NH3· H2O调节溶液的pH值, 使得pH值为6.0~7.0。 在水浴温度为60 ℃的条件下, 持续加热搅拌回流8 h, 分离得粉末状粗产物。 将粗产物用二次蒸馏水和无水乙醇洗涤3次, 置于30 ℃烘箱中烘干, 即得到稀土-全反式维甲酸-L-缬氨酸三元配合物。

用无水乙醇和Tris-HCl缓冲溶液溶解配体及其配合物, 配制成1× 10-3 mol/L的溶液待用。

1.2.2 配合物抗肿瘤活性实验 细胞培养:将1640培养液(含10%胎牛血清的)转移进装有癌细胞的离心管, 震荡使之混合均匀, 再按照需要加入适量的培养液, 最后转移进培养瓶。 在显微镜下观察细胞形态, 并置于37 ℃, 5%CO2饱和湿度的培养箱中, 细胞呈单层贴壁生长, 用倒置的显微镜观察细胞生长情况和贴壁形态, 并取指数生长期的肿瘤细胞(HepG2、A549和Hela)用于实验。

配合物溶液配制:称取一定量的三元配合物装入用高压灭菌过的2 mL塑料小试管, 用少量无水乙醇溶解(保证无水乙醇的量在每孔中体积分数不超过0.5%), 再用PBS缓冲溶液稀释至1× 10-3 mol/L做为母液待用。

细胞活力的测试:将培养瓶中培养好的细胞接种于96孔培养板(细胞密度1× 104个/mL)中, 待贴壁后, 分别加入不同浓度的三元配合物20 μ L(含0.1 μ L的无水乙醇)和180 μ L的1640培养基, 对照组加等体积的1640培养基, 每组6复孔, 平行4复孔, 并置于37 ℃, 5%CO2的细胞培养箱, 培养24 h后, 每孔加MTT溶液10 μ L, 培养箱中孵育4 h后终止培养, 小心吸取上层上清液后, 向每孔中加入150 μ L的DMSO, 在微量振荡器上振荡5 min后用酶标仪(波长570 nm)测定其吸光度值, 计算细胞的生长存活率。 用只加培养液而不加细胞的孔调零[8]。 细胞存活率按下列公式计算:

细胞存活率/%= 实验组A570对照组A570× 100, 抑制率/%=(1-细胞存活率)× 100

1.2.3 配合物与DNA作用 1)荧光光谱(激发波长均为425 nm):DNA对EuL2L'配合物荧光光谱的影响 在室温下, 1× 10-4 mol/L的EuL2L'配合物溶液加入DNA(1× 10-3 mol/L)的溶液, 摇匀静置0.5 h后, 扫描配合物-DNA体系荧光发射谱图。

EuL2L'对EB-DNA体系荧光强度的影响 将EuL2L'(1.0× 10-4 mol/L)取不同量依次加入EB-DNA体系溶液中(c(EB)/c(DNA)=12.5), 0.5 h后, 扫描其荧光发射谱图。

EB对EuL2L'-DNA体系荧光强度的影响 将不同量的浓度为1.25× 10-3 mol/L溴化乙锭(EB)加入EuL2L'-DNA(c(配合物)/c(DNA)=2.5)体系中, 0.5 h后, 扫描其荧光发射谱图。

2)黏度研究:分别将不同量的稀土配合物溶液和DNA的溶液(DNA浓度为1× 10-3 mol/L)混合, 1、48和96 h后, 以DNA溶液(1× 10-3 mol/L)为参比, 测定黏度。 采用同样的方法测测得EB-DNA溶液的黏度。

2.1.1 配合物的组成及一般性质 新制备的4种稀土(Nd3+、Eu3+、La3+、Sc3+)-全反式维甲酸-L-缬氨酸的配合物为粉末状固体, 产率为74%左右。 较易溶于无水乙醇和DMSO, 难溶于水, 其溶解性与单独的稀土盐、全反式维甲酸和L-缬氨酸有所不同, 经洗涤和重结晶可提纯。 通过元素分析的测试结果可以看出, 与理论值基本吻合, 结合热重-差热分析测试结果, 推测配合物的化学组成为REL2L'· nH2O。 以下图、表中L=全反式维甲酸(ATRA); L'=L-缬氨酸。元素分析结果见表1。

2.1.2 红外光谱 图1和图2分别为配体全反式维甲酸、L-缬氨酸以及4种配合物的红外图谱。 由图可以看出, 4种稀土配合物的谱图极为相似, 说明配合物的结构相似。 表2是配合物及配体的红外光谱数据, 由表2数据可以推断出, 配体的特征吸收峰在配合物的图谱中发生了较为明显的位移, 它们的强度也发生了一些变化, 这就说明稀土离子与全反式维甲酸、L-缬氨酸发生了配位。

稀土三元配合物与配体全反式维甲酸和L-缬氨酸中的— COOH的氧原子发生了配位, 具体表现是, 3000~2500 cm-1处羧基的吸收峰变弱, 且配位后配体中1586 cm-1处的峰位置发生了红移的现象, 这可能是因为羰基氧原子与金属发生配位后电子云密度降低所致。 但也发现4种配合物的红外光谱中有个别峰的位置有所变化, 峰的强度不完全相同, 说明不同金属与配体形成配合物时, 金属离子与配位原子之间的作用强弱不同。

2.1.3 配合物的热分解性 配合物的热重-差热(TG-DTA)数据列于表3。

由NdL2L'· 9H2O配合物的热谱图(图3)可以看出, 在室温~100 ℃时, 第一个失重台阶出现(失重率15.9%), 在100~450 ℃时, 第二个失重率为60.2%失重台阶出现, 在450~550 ℃, 第三个失重率8.0%失重台阶出现, 初步推断可能是三个阶段分别失去了9个结晶水分子、2个全反式维甲酸分子和1个L-缬氨酸分子。随着温度的不断升高, 稀土配合物不断分解, 在500 ℃左右出现了一个放热峰, 且伴随有失重现象, 当温度到600 ℃左右时, 热重曲线基本上趋于恒定(总失重率为84.2%), 稀土配合物最终分解为稀土氧化物, 经过计算与理论值基本相符。 由于几种稀土配合物的热谱图较为相似, 进而推断它们也具有相似的结构[9]。 对照维甲酸和L-缬氨酸的骨架断裂峰的温度, 可以发现, 所形成配合物的骨架断裂峰温升高, 这表明配合物的稳定性大于游离配体。

2.1.4 配体及配合物的光谱性质 配合物和配体全反式维甲酸(L-缬氨酸在测试的范围内没有吸收)紫外-可见光谱图如下。 由图4看出, 在浓度相同的条件下(1× 10-4 mol/L), 几种配合物的紫外吸收峰比配体的吸收略有红移, 但从吸收强度上来看, 配合物溶液的吸收强度高于配体全反式维甲酸。 其中Nd3+、La3+和Sc3+配合物的紫外吸收强度大大增加。 这可能是, 由于配体中的氧原子与稀土离子形成配位键后, 配位原子的电子云向稀土离子的空轨道转移, 配体中共轭电子的离域化程度增加, 电子跃迁的能级差有所减小, 导致配合物对紫外光的吸收作用增强并产生了红移。

采用MTT法测试了稀土硝酸盐、配体全反式维甲酸和L-缬氨酸的抗肿瘤活性, 测试的细胞株种类为体外培养的人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549和人宫颈癌细胞Hela。 阳性对照药为顺铂, 阴性对照为不加细胞的等体积的培养液, 表4为稀土盐类、配体和配合物对不同肿瘤细胞瘤株的IC50值, 其中阳性对照物顺铂在测试的最大浓度时抑制率未超过50%, 而配合物的浓度在某些范围内抑制率超过了50%, 即达到IC50值, 由此可说明配合物的抑制率强于顺铂。

2.2.1 配体和稀土配合物对人肝癌细胞HepG2的抑制作用 在浓度为1× 10-8~1× 10-3 mol/L的范围内, 配体全反式维甲酸和L-缬氨酸及其4种配合物对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用如图5所示。 由表4和图5可以看出:1)配体全反式

维甲酸和L-缬氨酸对人肝癌细胞HepG2增均有一定的抑制作用, 但L-缬氨酸的抑制作用非常的弱; 2)在浓度为1× 10-8~1× 10-7 mol/L时, 稀土Sc3+的三元配合物的抑制作用在此浓度条件下对癌细胞的抑制作用强于全反式维甲酸, 稀土Nd3+的三元配合物对癌细胞的抑制作用与全反式维甲酸相当, 稀土Eu3+和La3+的配合物对癌细胞的抑制作用低于配体全反式维甲酸; 3)在浓度为1× 10-7~1× 10-4 mol/L时, 稀土Nd3+、Eu3+、La3+和Sc3+的4种配合物对人肝癌细胞HepG2增殖的抑制作用基本上都强于两种配体, 且稀土Sc3+的三元配合物的抑制作用大大强于其它3种配合物; 4)在浓度为1× 10-4~1× 10-3 mol/L时, 4种配合物对癌细胞的抑制作用的趋势是, 随着药物配合物浓度的增加抑制作用逐渐增强; 5)通过以上讨论可以总结出, 稀土Eu3+、Sc3+的配合物对人肝癌细胞具有较强的抑制作用, 这对此类药物的设计、研发提供了一定的试验依据。

2.2.2 配体和配合物对人肺癌细胞A549的抑制作用 在浓度为1× 10-8~1× 10-3 mol/L的范围内, 配体全反式维甲酸和L-缬氨酸及其4种配合物对人肺癌细胞A549增殖的抑制作用如图6所示。 由表4和图6可以看出:1)在浓度为1× 10-81× 10-3 mol/L时, 配体L-缬氨酸几乎无抑制作用, Nd3+、La3+的配合物对癌细胞的抑制作用比配体全反式维甲酸的低, Sc3+配合物的抑制作用与全反式维甲酸相当, Eu3+配合物的抑制作用强于两种配体; 2)在浓度为1× 10-7~1× 10-5 mol/L时, Nd3+、Eu3+、Sc3+ 3种配合物的抑制作用随着配合物浓度的增加在逐渐增大, 且稀土Eu3+配合物的抑制作用高于其他配合物, 只有稀土La3+配合物的抑制作用小于全反式维甲酸; 3)在浓度为1× 10-5~1× 10-3 mol/L时, 4种稀土三元配合物对人肺癌细胞的抑制作用均强于两种配体, Sc3+配合物的抑制作用随着浓度的增加较快; 4)从总的趋势来看, 稀土Eu3+配合物对人肺癌细胞A549的增殖具有较好的抑制作用, 有必要进一步进行研究。

2.2.3 配体和稀土配合物对人宫颈癌细胞Hela的抑制作用 在浓度为1× 10-8~1× 10-3 mol/L的范围内, 配体全反式维甲酸和L-缬氨酸及其4种配合物对人宫颈癌细胞Hela增殖的抑制作用如图7所示。 由表4和图7可以看出:1)在浓度为1× 10-81× 10-7 mol/L时, La3+的配合物对人宫颈癌细胞Hela增殖的抑制作用比配体全反式维甲酸的低, 稀土(Eu3+、Sc3+)的配合物对癌细胞的抑制作用与全反式维甲酸的比较接近; 2)在浓度为1× 10-6~1× 10-3 mol/L时, 4种配合物的抑制作用随着配合物浓度的增加在逐渐增大, 浓度和抑制率呈线性变化, 比较它们变化的趋势图, 可以看出抑制作用为Sc3+> Nd3+> Eu3+> La3+; 3)从图中可以看出, 稀土Nd3+、Sc3+配合物的半数抑制浓度为1× 10-4 mol/L, 稀土Eu3+、La3+配合物的半数抑制浓度为1× 10-4 mol/L; 4)对于人宫颈癌细胞Hela而言, 对其增殖的抑制作用较好的是稀土Nd3+、Sc3+配合物, 在浓度为1× 10-3 mol/L时, 抑制率高达75%以上。

对稀土离子、两种配体和4种新型稀土三元配合物抗肿瘤活性的实验结果可以看出, 在较低的浓度范围内, 配合物抑制率较低, 当浓度增大时, 4种新型的配合物对所测试的3种肿瘤细胞株的抑制率一般强于金属硝酸盐、配体全反式维甲酸和L-缬氨酸。

本文中合成的配合物依金属原子的不同呈现不同的抗肿瘤活性, 可能与稀土离子各自的半径、所带的有效核电荷有关。 在浓度为1× 10-3 mol/L时, ScL2L'配合物对3种肿瘤细胞的抑制最强, 抑制率在70%以上, 其它3种配合物的抑制率超过50%, 然而, EuL2L'对人肺癌细胞的抑制率和ScL2L'的抑制率相当, 且EuL2L'对三株肿瘤细胞的抑制率的变化趋势呈线性相关, 说明EuL2L'和ScL2L'配合物在抗肿瘤药物的研发上有较好的应用前景。本课题组曾对稀土(Nd3+、Eu3+、La3+、Sc3+)-全反式维甲酸-精氨酸配合物对HepG2、A549和Hela肿瘤细胞增殖的抑制进行过研究[10], 结果表明, 当配合物浓度为1× 10-3 mol/L时, ScL2L'Cl配合物对3种肿瘤细胞的抑制最强, 抑制率在80%以上, 其它3种配合物的抑制率超过60%。 对比说明Sc的全反式维甲酸-缬氨酸/精氨酸配合物有较大的潜在药物使用价值。

为进一步探讨配合物对肿瘤细胞的抑制机理, 以EuL2L'为例, 采用荧光光谱和黏度法研究了该配合物与药物靶分子DNA的作用。

2.3.1 EuL2L'与DNA作用的荧光光谱 DNA对EuL2L'的荧光光谱的影响:图8为随着DNA 的加入, 配合物EuL2L'的荧光发射变化的光谱图。 由图8可以看出, 不加DNA的时候, 配合物EuL2L'的最大吸收峰出现在490 nm处。

c(EuL2L')= 1× 10-4 mol/L; the concentration of DNA (a→ e):0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 and 70 μ mol/L

c(EuL2L')= 1× 10-4 mol/L; the concentration of DNA (a→ e):0, 10, 20, 30, 40, 50, 60 and 70 μ mol/L

随着DNA的不断加入, 配合物EuL2L'的荧光吸收强度增大, 产生了一定的增色效应, 这是因为DNA双螺旋结构内部的疏水环境限制了溶剂水分子与配合物的结合, 配合物小分子被限制在某个结合位点, 与DNA发生了强烈的电子作用引起的[11], 这和我们已经熟知的一些小分子嵌入试剂引起荧光强度的改变是一致的[12, 13], 故可以推断配合物与DNA的作用是嵌入式的。

EuL2L'对EB-DNA体系荧光光谱的影响:溴化乙锭(EB)常被用来作为探针考察小分子与DNA相互作用的模式, 它本身的荧光非常弱, 但与DNA结合后, 荧光强度会显著增强, 这是因为EB与DNA的碱基对发生了强烈的嵌插作用[14]。 当向EB-DNA体系中加入不同量的配合物EuL2L', EB-DNA体系的荧光强度发生了显著的变化(图9)。 由图9可以看出, 随着EuL2L'的浓度不断增加, EB-DNA体系的最大发射波长没有明显的变化, 但是荧光强度随着EuL2L'浓度的增加呈减弱的趋势, 这就说明EuL2L'与DNA发生了与EB类似的作用形式, 即嵌入式。

EB对EuL2L'-DNA体系荧光强度的影响:EB对EuL2L'-DNA体系荧光强度的影响见图10。 由图10可以看出, 当向EuL2L'-DNA体系加入EB时, 随着EB浓度的不断增加, 该体系的荧光强度逐渐减弱, 减弱的程度随着EB浓度的增加而增强, 而在600 nm处, 出现了EB-DNA体系的荧光发射峰, 该体系吸收峰的强度随EB浓度的增加逐渐增强, 说明EB被加入后与EuL2L'竞争结合DNA, EuL2L'被取代, NdL2L'Cl-DNA体系的荧光强度减弱, EB-DNA体系的荧光强度增加。 这进一步说明了配合物EuL2L'与DNA发生了类似于EB的结合形式, 即嵌入式[15, 16]。

2.3.2 EB和EuL2L'对DNA粘度的影响 为进一步确定配合物与 DNA的作用方式, 用粘度计在20 ℃测定了 DNA在EB、EuL2L'配合物存在时的粘度变化, 结果列于表5。

通过表5可以看出, DNA的相对粘度随着EB和配合物EuL2L'浓度的增加而增大, 据此进一步说明配合物EuL2L'与DNA的作用方式, 确实和EB与DNA的作用方式有所相似, 为嵌入形式[17]。 这与配合物EuL2L'与EB竞争结合DNA的荧光法试验结果是一致的。

在乙醇-水介质中, 经60 ℃水浴加热合成了4种稀土(Nd3+、Eu3+、La3+、Sc3+)三元配合物。对其进行红外光谱、热重-差热法、紫外光谱、荧光光谱和元素分析等测试, 推测其化学组成为RE(ATRA)2(L-Val)· nH2O。 4种稀土配合物对三株肿瘤细胞抗肿瘤实验表明, 在一定的浓度范围内, 配合物的抗肿瘤活性优于金属硝酸盐、配体全反式维甲酸和L-缬氨酸, 当配合物浓度为1× 10-3 mol/L时, ScL2L'配合物对3种肿瘤细胞的抑制最强, 抑制率在70%以上, 其它3种配合物的抑制率超过50%, 说明ScL2L'配合物有较大的潜在药物使用价值。 通过研究配合物与DNA的相互作用方式, 初步说明配合物分子嵌入DNA碱基对之间, 是配合物具有抗肿瘤活性的原因之一。