2）感兴趣细胞类群亚群细化

对每个cluster细胞鉴定完成后，还可以对感兴趣的细胞进一步做类型细分，分析各个小亚群细胞差异及研究小亚群在生物学过程中参与的功能。比如上图鉴定结果中的1592个内皮细胞可以分为6个sub-clusters，24911个T细胞可以细分为9个sub-clusters，并根据marker基因将这些sub-clusters分配给已知的内皮/T细胞类型进行更深入的研究（图片来源-文献【1】）。

3）两种不同cluster/细胞或两种不同处理间差异比较

在进行单细胞差异分析时，一般采用的策略是目标cluster与其他所有cluster细胞间进行差异分析，但在实际研究中，往往需要研究某两类cluster或某两类细胞之间的差异，或者是某一类细胞在不同处理样本间的差异基因情况，因此需要将待比较的cluster提取出来单独进行分析。如文献【2】中，骨髓来源内皮细胞（BMEC）可以细分为3个不同的细胞sub-clusters：动脉血管内皮细胞（Arterial BMECs）、小动脉血管内皮细胞（Arteriolar BMECs，aBMECs）和窦状血管内皮细胞（sinusoidal BMECs，sBMECs）。对动脉血管内皮细胞和小动脉血管内皮细胞进行差异基因分析，发现两个cluster间具有不同的的基因表达模式（下图左显示两个cluster间显著性差异基因火山图），说明动脉血管内皮细胞可能是BMEC的一个特殊亚群。同样在文献【3】中，通过对两种不同T细胞之间进行差异基因分析，可以明显看到两种T细胞亚群之间的基因表达差异（下图右）。

4）拟时序分析

拟时序分析也称为轨迹分析，最开始拿到的单细胞转录组测序数据，并未直接告诉我们每一个细胞处在什么状态下，因此需要借助一些分析方法来实现轨迹上的排序，以推算潜在的细胞之间的演化关系。拟时序分析方法思路及图表意义请参考：10X单细胞转录组个性化分析-拟时序分析 。对不同发育时期小鼠SSC（spermatogenic stem cell，精原干细胞）细胞进行拟时序分析获得的结果与发育的年龄是一致的（下图左），并确定了4种主要的基因表达动力学模式（下图右，参考文献【4】）。

当然，除了以上4种常见的分析套路外，还可以根据自身的研究目的选择细胞周期分析，细胞间的互作分析，单细胞CNV分析，RNA速率分析、WGCNA分析等诸多个性化分析。最后，再强调一遍，细胞鉴定对整个单细胞转录组的研究是至关重要的，因此，建议在前期课题设计时应尽可能多的收集组织中相关细胞类别，以及各细胞特异性marker基因。

【相关参考文献】：

【1】Lambrechts, Diether, et al. "Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment." Nature medicine 24.8 (2018): 1277-1289.

【2】Baryawno, Ninib, et al. "A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia." Cell 177.7 (2019): 1915-1932.

【3】Zhang, Lei, et al. "Lineage tracking reveals dynamic relationships of T cells in colorectal cancer." Nature 564.7735 (2018): 268-272.

【4】Law, Nathan C., Melissa J. Oatley, and Jon M. Oatley. "Developmental kinetics and tranome dynamics of stem cell specification in the spermatogenic lineage." Nature communications 10.1 (2019): 1-14.返回搜狐，查看更多