中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells, CHO cells)是单克隆抗体(monoclonal anti-bodies, mAbs)及其它蛋白质生物制剂的工业化生产中应用最广的哺乳动物宿主细胞。CHO细胞大行其道的原因很多。首先是得益于自身的特性，例如与人相似的蛋白质翻译后修饰，对感染人的病毒有较强的抵抗力，易于在化学成分明确的无血清培养基(chemically defined serum-free medium, CDSFM)中大规模培养等。此外，由于应用较早，漫长的安全生产历史和数据积累也成就了CHO细胞的地位。然而，不可否认的是，CHO细胞的另一些特性也历来被人们诟病——克隆筛选不仅任务繁重，而且耗时长达6到9个月。为了蛋白质的生产获得成功，每个参与者都面临着巨大考验，而细胞株的开发者首当其冲。细胞株构建始于DNA转染，表达序列与筛选基因会同时进入CHO细胞中，并有机会整合到基因组中。由于CHO细胞的基因组不稳定，这群CHO细胞从转染前就是异质性群体，而在转染后，那些同样整合了载体DNA的细胞，其插入位点和数量也是千变莫名的。因此，细胞池(pool)中活下来的细胞，比它们在转染前具有更大的异质性。即是说，CHO细胞的细胞特异性表达水平，既缘于序列插入位点和拷贝数的差别，又会受到亲代CHO细胞的异质性影响。不难想象，在这样一个充满差异的群体中，同时满足生长健康，稳定性好和蛋白质产量高三个条件的细胞个体少之又少。

       所以，从成千上万个克隆当中把它们筛选分离出来无疑是一项挑战。 除了整合位点，拷贝数和宿主细胞遗传差异之外，转染过程带来的损伤，目的基因的过表达，筛选过程中使用的细胞毒性药物等，也是高产克隆稀少的诱因。在重重压力之下，低产甚至不产重组蛋白的克隆似乎更有优势。当重组蛋白在内质网(endoplasmic reticulum, ER)中大量合成，细胞为了维持内质网稳态，将激活三个信号通路：未折叠蛋白响应(unfolded protein response, UPR)，内质网过载响应(endoplasmic reticulum overload response, EOR)和内质网相关蛋白降解(ER-associated protein degradation, ERAD)。起初，UPR的激活将通过求生机制帮助细胞存活，如减少蛋白合成，上调蛋白折叠所需关键成分，或使细胞周期停滞于G1期。倘若内质网压力持续下去，稳态无法恢复，就会进一步触发细胞的凋亡。不难想象，在克隆筛选过程中，细胞持续高表达重组蛋白可能会导致细胞疲于应对内质网压力，从而在生存与增殖方面处于劣势。筛选药物的引入更是雪上加霜，使细胞更加容易凋亡或坏死。 从理论上讲，使用诱导表达系统来限制筛选过程中重组蛋白的表达，将有利于潜在的高产克隆存活下来。

       但是，诱导表达系统在CHO细胞中的应用一直存在桎梏。据报道，使用四环素响应的启动子来驱动有表达困难的mAbs，可以提高克隆的稳定性，原因可能与减少了错误折叠抗体的积累有关。无独有偶，该诱导表达系统还成功地表达了DNaseI，一种过表达对CHO细胞有毒的蛋白质。虽然这些研究证明了诱导表达系统在表达细胞毒性蛋白时的特殊价值，但诱导表达对于表达无毒重组蛋白的意义尚不明确。因此，作者试图探究诱导表达系统对常规重组蛋白的CHO细胞构建是否有利。 作者曾开发了基于枯盐开关的诱导表达系统，并已证明枯盐调控的启动子比组成型的CMV启动子更具优势，仅3周即可生成稳定高产的CHO细胞池(400~900 mg/L)。此外，作者还发现上述方法产生的细胞池经过反复冻融，或经MSX(methionine sulfoximine)筛选培养一个月以上，其合成重组蛋白的能力均不受影响。 本研究表明，枯盐诱导表达系统不仅有利于建成稳定的细胞池，还能够提升高产细胞株的出现率。作者以Fc融合蛋白hCD200Fc为模式蛋白，证明了MSX筛选过程中重组蛋白基因的低表达(“关闭模式”)可以使CHOBRI/rcTA细胞池在fed-batch培养中，相较筛选过程中持续高表达(“开启模式”)的细胞池，获得2倍的产量提升。进一步研究表明，维持hCD200Fc高表达的内质网反应使GRP78/Bip水平升高，引发细胞活率与增殖速度的降低。即是说，在MSX压力筛选阶段，组成型启动子驱动重组蛋白高表达将带来内质网压力，不利于高产克隆存活和扩增，相应的，低表达细胞反而取得了竞争优势。而诱导表达系统可以灵活开关重组蛋白的表达，规避上述问题，因此能够高效地获取高产细胞株，降低成本。

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筛选过程中重组蛋白表达不利于细胞的增殖与存活

       CR5诱导型启动子控制的hCD200Fc基因，由pTT75-hCD200Fc质粒搭载，转染到CHOBRI/rcTA细胞。转染次日开始MSX压力筛选。实验组Cum0不添加枯盐，对照组Cum1在1 μg/mL枯盐诱导下持续表达重组蛋白hCD200Fc。每2~ 3天取样，以台盼蓝染色法检测活率，用FITC(fluorescein isothiocyanate, 异硫氰酸荧光素)连接的抗人类IgGFc特异性抗体标记细胞中表达的hCD200Fc，并做流式分析(图1 A)。可以看到，早期的两组细胞中，hCD200Fc均有较高的表达，随后由于枯盐诱导开关的作用，Cum0仅有少量泄露表达，而Cum1持续高表达。另一方面，hCD200Fc的持续高表达显然不利于细胞的恢复，Cum1在中期的活率一直显著低于Cum0。

图1 筛选过程中hCD200Fc的表达不利于细胞的增殖与存活

       为了证明这种效应不是枯盐本身造成的，作者将pTT75空载转入并重复了上述实验(图1B)。显然，在无重组蛋白的情况下，Cum1和Cum0没有显著差异。有趣的是，没有了表达重组蛋白的负担，细胞在MSX压力下的活率甚至不会降到80%以下。 从细胞生长速率来看，在筛选前中期，Cum0比Cum1有很大优势，Cum1的细胞数甚至在第4天和第6天负增长(图1C)。同样，这种效应也不是枯盐本身造成的(图1D)。

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筛选阶段的重组蛋白过表达使Bip表达量和annexin V阳性细胞数增加

       位于内质网的葡萄糖调节蛋白GRP78/Bip是一种蛋白分子伴侣，其表达量的升高是内质网压力增大的标志之一。作者在pTT75-hCD200Fc和pTT75转染的细胞中同时用western blot检测重组蛋白及Bip的表达，并用丽春红(Ponceau Red)监测上样的总蛋白(图2 A)。与图1A的结果一致，诱导状态下hCD200Fc的表达量确实远高于非诱导的Cum0(图2B)。在所有细胞中，Bip表达量从第4天开始也有显著上升(图1C)，这可能与谷氨酰胺耗尽有关。然而，被诱导合成hCD200Fc的细胞始终具有最高的Bip表达水平，表明它们承受了更大的内质网压力。

图2 筛选过程中hCD200Fc的表达使Bip表达上调并使annexinV阳性细胞增多 Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，而碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色可以进一步区分早期凋亡细胞和晚期凋亡或坏死的细胞。可以看到，尽管4组细胞在早期凋亡细胞(Annexin V阳性，PI阴性)的比例上没有显著差异(图2D)，但是过表达hCD200Fc的细胞(whitecolumn)中晚期凋亡或坏死细胞(Annexin V、PI双阳性)比例显著升高(图2E)。 这些结果表明，伴随着MSX筛选的进行，重组蛋白的高表达将使细胞内外交困，导致更多的细胞走向凋亡或坏死。

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筛选中减少重组蛋白的表达有利于获取高产细胞池

       为了本诱导表达系统对细胞池的影响，作者用诱导关闭和开启两种模式构建的细胞池，同时设定诱导和非诱导条件进行了fed-batch培养。细胞活率与活细胞密度监测至D17，活率下降到60%左右为止(图3A)。尽管4组细胞的活率没有显著差异，筛选过程中表达关闭的细胞(Cum0)在诱导下的活细胞密度比不诱导(non-induced Cum0)降低了38% (图3B)。事实  

图3 细胞池Cum0和Cum1在fed-batch中的表现 上，诱导培养的活细胞密度(viable cell density, VCD)峰值仅为1.0 × 107 cells/mL左右，远低于非诱导培养的1.6 × 107 cells/mL，而累积活细胞密度(integral of viable cell density, IVCD)比非诱导培养低30%(图3C)。但Cum1的诱导培养中，VCD在第12天才相对于Cum1非诱导培养有显著下滑，而两者的IVCD无显著差异。这就暗示只有筛选阶段关闭了重组蛋白表达的Cum0，才能受到cumate的强诱导，大量合成抗体，并因此放慢增殖的步伐。对数期(fed-batch的第2至第7天)的特征性生长速率检测结果也支持这一推想(图3D)。整个fed-batch实验中，不诱导建成的细胞池Cum0比持续诱导建成的细胞池Cum1，无论最终蛋白产量和中途产率，都一直维持在2倍左右(图3E、F)。作者已经看到，这两组细胞的IVCD没有显著差异，那么Cum0很可能拥有更多的高产克隆。

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重组蛋白表达减少促使筛选池中高产细胞株所占比例提高

       为获得充足的数据来比较高产克隆的频度，作者构建了微池(micro-pool or μ-pool)。即用有限稀释法将细胞铺入384孔板，但每孔细胞数期望值为5。该条件下，绝大多数孔中的细胞能够生长起来，且通过覆盖度(confluence)来评估生长情况时，Cum0和Cum1是高度一致的(图4)。因此，检测重组蛋白在两组细胞的μ-pool中的表达量，就能反映高产细胞株频度。  

图4 细胞微池的生长状态评估 结果表明，Cum0的μ-pool中重组蛋白hCD200Fc的浓度显著高于Cum1。浓度100 mg/L以上的μ-pool，Cum1仅有1个，而Cum0多达14个(图5 A)。将μ-pool 的覆盖度纳入计算，得到的相对产量具有相同的趋势(图5 B)。统计结果显示，Cum0组有22%的μ-pool相对产量高于40，而Cum1的这一比例仅为3.3%。显然，Cum0拥有更多的高产μ-pool(图5C)。有趣的是，Cum0的低产（相对产量小于10）μ-pool也要远少于Cum1。 归结起来，在Pool筛选阶段不诱导重组蛋白的表达，将帮助更多更高产的细胞存活下来，从而有利于高产细胞株的构建。  

图5 细胞池筛选中重组蛋白的表达关闭将增加高产细胞的频度

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结语

       在工业化CHO细胞株开发的过程中，主要目标就是筛选获得高效稳定生产重组蛋白的单克隆。尽管人们从多方面做了大量改进，克隆筛选仍然困难重重。高产克隆频度低下的原因很复杂，可能包括了整合位点的位置效应，整合拷贝数，转染引发的胁迫，筛选药物本身以及目的基因过表达等等。倘若目的蛋白具有细胞毒性，那么诱导表达系统的优势是不言而喻的。但是，诱导表达系统对非毒性蛋白表达的意义却鲜有报道。 本研究使用枯盐诱导开关和CHOBRI/rcTA细胞系表达重组蛋白hCD200Fc，对诱导表达系统表达非毒性蛋白的意义进行了一番探索。首先，对转染后的CHOBRI/rcTA做筛选获得Cum1和Cum0两个Pool。在筛选过程中，Cum1由1 μg/mL cumate持续诱导hCD200Fc表达，来模拟组成型启动子的情况，而Cum0不添加cumate，目的蛋白表达受到抑制。这样，它们就分别代表了组成型表达系统和诱导表达系统构建的Pool。然后，作者进行了fed-batch，μ-pool评估等实验来比较两个pool的高产克隆频度。最终，数据结果显示诱导表达系统对非毒性蛋白表达细胞株的构建也有积极意义，hCD200Fc表达关闭的Cum0组保留了更多更高产的克隆，从而在后续的诱导表达和克隆筛选中具有极大的优势。 值得一提的是，与转染了空载pTT75的细胞相比，作者发现hCD200Fc的表达使宿主细胞不堪重负：筛选前期，每个细胞中的质粒拷贝数较高，重组蛋白的大量表达使细胞的增殖速率下滑，活率降低。和之前的一些研究相同，内质网压力标记基因GRP78/Bip在筛选过程中上调。

       为了把表达重组蛋白带来的胁迫和电转、筛选等外部胁迫区分开来，对pTT75空载转染的细胞也进行了Bip表达检测，结果表明，被诱导表达hCD200Fc的细胞，其Bip表达水平确实显著高于空载对照。 借助流式细胞术，作者已经看到，在MSX压力筛选过程中过表达hCD200Fc的细胞，比表达抑制的细胞更容易死亡。尽管细胞死亡是多方面原因促成的，筛选过程中的内质网压力可能是重要的影响因素。2013年，Hu等用实验证明了CHOK1比DUXB11具有更高的高表达克隆存活率。对此，他们作了与本文呼应的猜想，即CHOK1的内质网比DUXB11的内质网更大，抗压能力更强，因而更容易在高表达重组蛋白的同时，在筛选中存活下来。 综上所述，作者的数据有力地支持了MSX压力筛选中重组蛋白不宜持续高表达。重组蛋白的大量合成加重了细胞的负担，而其对CHO细胞本身往往毫无用处，使克隆在外部压力下更难存活，最终导致筛选结束时高产克隆占比很少。为此，作者构建了诱导表达系统，并同时在诱导表达和不诱导表达的状态下进行实验，证明筛选阶段重组蛋白的表达抑制可以减轻高产克隆的负担，使之更易存活，从而增加筛选结束时高产克隆的占比，给接下来的单克隆筛选带来利好。