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验证基因已成功克隆的方法

接近克隆工作流程完毕的时候。 将DNA片段连接到选择的载体中并转化到大肠杆菌细胞中。 将经过转化后的细胞转移到选择性培养基，倒置培养过夜，获得大量菌落。 

如何才能确保重组克隆的准确性呢？ 在确定克隆成功之前，需要对重组克隆进行筛选和鉴定。下面列出的是5种最常用的方法。

1.蓝白筛选法

蓝白筛选法，又叫β-半乳糖苷酶显色法，广泛用于检查克隆是否成功。在该方法中，将外源DNA克隆到含有编码α-半乳糖苷酶功能性亚基的lacZα序列的载体中。多克隆位点位于lacZα序列内。

该质粒必须转化成具有lacZΔM15突变的特定大肠杆菌菌株。由于α-肽（β-半乳糖苷酶）的活性保持完整，空载体会产生蓝色菌落。

筛选板中提供的无色X-gal（乳糖类似物）被β-半乳糖苷酶水解形成蓝色颜料（5,5'-二溴-4,4'-二氯 - 靛蓝）。如果载体含有破坏lacZα序列的DNA插入片段，则α肽不会被表达，X-gal也不会被水解。因此，如果存在外源DNA，则菌落将是白色的。

该实验有可能出现假阳性（没有外源DNA的白色菌落），因此建议对白色菌落进一步确认。

2.正向选择向量

简化筛选的有效方法是使用正向选择向量。阳性选择载体有条件地表达致死基因，例如消化细菌宿主的基因组DNA的限制酶。

通过将DNA插入片段连接到克隆位点来破坏致死基因的表达。结果，只有具有重组质粒的细胞才能生长。

这种方法可以节省时间和成本，因为它通常会产生> 99％的重组克隆。 Thermo Scientific CloneJET PCR克隆试剂盒采用阳性克隆选择方法。

3.限制酶酶切法

还可以进行限制酶消化以确定正确的插入片段。首先，使用质粒小量制备试剂盒（如Thermo Scientific GeneJET Plasmid Miniprep试剂盒）从过夜细菌培养物中分离质粒DNA。

我们的REsearch限制性位点映射工具可用于确定给定序列中的限制性位点。选择限制性内切酶，可以让您轻松确定质粒是否含有插入片段。然后，用限制性内切酶从重组克隆中消化纯化的质粒DNA。

为了获得快速的结果，我们推荐Thermo Scientific™FastDigest™限制酶。在琼脂糖凝胶上运行消化的质粒，验证载体骨架和插入片段是否具有预期的大小。

4.菌落PCR

也可以使用PCR筛选细菌菌落的方法来确定DNA插入物的存在。引物可以是插入特异性的，载体特异性的或两者以检测插入物。

为了确定插入物的方向，推荐使用载体特异性和插入特异性引物的组合。通过PCR进行的菌落筛选适用于短于3kb的插入片段。

使用Thermo Scientific™PCR试剂可以将单个菌落直接接入PCR主混合物。菌落的剩余部分可以用于接种培养平板或含适当抗生素的液体LB培养基用于下游应用。

5.测序

验证重组菌落最准确的方法事测序。首先从过夜细菌培养物中分离质粒DNA。插入片段可以使用适合于载体的测序引物通过Sanger测序来鉴定。需要对整个插入片段进行测序以验证插入的确切顺序。

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