Bt蛋白杀虫机理及在转基因植物上的应用

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1、Bt杀虫蛋白的发现历史

     1901年，日本人Ishiwatari在患“猝倒病”的家蚕幼虫体内首次分离出了苏云金芽孢杆菌，并将其命名为Bacillus sotto。1911年，德国人Berliner 在德国的苏云金地区，再次从患病的地中海粉螟（Ephestia kuehniella）中分离到了一个类似的细菌菌株，将其命名为Bacillus thuringiensis（Bt），该命名一直使用到今天。后来的研究发现，苏云金芽孢杆菌是靠土壤传播的，属于格兰仕阳性蜡状芽孢杆菌，是一类在孢子形成阶段能产生伴孢晶体蛋白的细菌。

      1927年，Mattes在法国恩斯特分离获得一个Bt菌株并进行了大田试验，证明该菌株对欧洲鳞翅目害虫玉米螟有显著的毒杀作用。1938年，该项研究成果被开发成为第一个商业杀虫剂Sporeine。该杀虫剂的问世，从此拉开了生物杀虫剂研究和应用的序幕。以后人们又相继发现了分别对鞘翅目、同翅目、膜翅目、直翅目昆虫、动植物寄生线虫、鞭毛虫、变形虫、扁虫中的吸虫、绦虫和螨类等有致病性的Bt菌株。

　　通过对Bt菌的深入研究，人们发现编码杀虫晶体蛋白（Insectcidal Crystal Proteins,ICPs）的基因存在于一个质粒上。该细菌偶尔也会因丢失质粒而失去产生晶体蛋白的能力，从而使其转变为蜡状芽孢杆菌群其他的细菌，蜡状芽孢杆菌群的其他细菌也可以通过获得编码晶体蛋白基因的质粒转变为苏云金芽孢杆菌。由于只有在孢子体阶段产生的多个RNA聚合酶才能调控质粒编码的ICPs表达，所以ICPs只有在Bt菌孢子形成阶段才能产生，孢子内大约有 20%的蛋白由ICPs组成。

　　以鳞翅目害虫粉螟幼虫为研究材料，人们对Bt晶体蛋白的杀虫机理进行了深入的研究，结果表明，孢子或者晶体蛋白只有随着取食叶片进入幼虫肠道内，才能导致幼虫死亡。苏云金芽孢杆菌主要靠寄生于昆虫体内进行繁殖，具体过程为昆虫取食孢子后，孢子内的杀虫晶体蛋白杀死昆虫并萌发产生营养体，在死亡昆虫体内繁殖产生大量孢子后释放出环境中，寻找新的寄主再次进行繁殖，不同的苏云金芽孢杆菌的寄主具有种属特异性。

　　利用苏云金芽孢杆菌的寄主具有种属特异性，目前开发出了很多能够特异毒杀各种昆虫的杀虫剂。该杀虫剂不仅是世界上应用最广泛、最成功的微生物杀虫剂，也是公认的无公害生物农药。同时利用苏云金芽孢杆菌特异毒杀昆虫的研究结果，将编码不同靶标害虫的Bt杀虫蛋白的基因克隆出来，利用基因工程技术将杀虫蛋白基因导入植物中提高植物的抗虫性，已经成为当今植物基因工程的研究热点之一，通过该方法已经获得了棉花、玉米、大豆和水稻等一系列的转基因农作物。转基因抗虫农作物的推广应用不仅提高了产量而且降低了农药的使用量，也体现出了巨大的社会、经济价值。

2、Bt杀虫蛋白的分类

　　经过近百年的研究，目前已报道了500多个Bt杀虫蛋白，依据杀虫作用方式将其分为四个类型：1）含有三个结构域Cry杀虫蛋白（3D-Cry）；2）杀蚊毒素蛋白（Mtx）和binary-like毒素蛋白（Bin）；3）溶细胞毒素蛋白（Cyt）；4）营养生长杀虫蛋白（VIP）。而在每一个类型下面，依据蛋白结构和氨基酸序列又可进一步分类。

　　目前，对于Bt杀虫蛋白的命名，一致采用四级命名法：1）一级命名依据杀虫蛋白类型的不同，用3个英文字母表示，如3D-Cry、Mtx、Cyt、Vip等；2）二级命名依据蛋白结构域不同，用一个阿拉伯数字表示，如Cry1、Cry2、Mtx2、Vip3等；3）三级命名依据氨基酸序列不同，用一个大写的英文字母表示，如Cry1A、Cry2A、Vip3A等；4）四级命名是在三级命名的基础上进一步细分，依据氨基酸序列差异，用一个小写的英文字母表示，如Cry1Aa、Cry2Aa等。

　　依据二级分类规则，3D-Cry蛋白数量最多，可以分为67类（Cry1~Cry67）；其次是Mtx蛋白和Bin蛋白类型，可分为40kDa、Mtx2、Mtx3、BinA和BinB；Cyt蛋白可以划分为3类，分别是Cyt1、Cyt2和Cyt3；VIP蛋白目前只报道了三类，分别是VIP1、VIP2和VIP3。

　　除了人工合成的杀虫蛋白基因外，3D-Cry杀虫蛋白作为含有成员数最多的Bt杀虫晶体蛋白类型，目前共报道了224个不同序列的天然存在的杀虫蛋白基因；Mtx蛋白和Bin蛋白共报道了5个天然存在的杀虫蛋白基因；Cyt蛋白共报道了11个天然存在的杀虫蛋白基因；VIP蛋白共报道了103个天然存在的杀虫蛋白基因。

　　系统进化分析表明，除了营养生长期杀虫蛋白VIP之外，其它三个不同类型的杀虫晶体蛋白之间3D-Cry蛋白与Mtx蛋白和Bin蛋白进化关系较近，而与Cyt蛋白亲缘关系较远。

       3D-Cry蛋白由α螺旋或β折叠组合形成3个Domain，通过与昆虫肠道细胞表面的特异受体蛋白识别结合，能够使昆虫肠壁细胞形成穿孔，该类蛋白对昆虫毒杀的特异性好。Mtx蛋白和Bin蛋白结构和受体识别特点与3D-Cry蛋白类似。Cyt蛋白由2个α螺旋包裹着一个发卡结构的β折叠形成一个结构域组成，能够识别昆虫肠道细胞膜脂，只有在与肠壁细胞膜脂结合后才能形成细胞膜穿孔，该类蛋白对昆虫毒杀的特异性不好。

       VIP蛋白由α螺旋或β折叠组合形成一个结构域组成，该蛋白是在苏云金芽孢杆菌营养生长期分泌至胞外的一种杀虫蛋白，能够识别昆虫肠道内的特异受体，但与3D-Cry蛋白受体不同，也能够使昆虫肠壁细胞形成穿孔，对特定昆虫毒杀的特异性好，杀虫谱较广。

　　迄今为止，已有多个ICPs和VIP蛋白的三维结构获得了解析，如Cry1Ac、Cry1Aa、Cry2Aa、 Cry3Aa、Cry3Ba、Cry4Aa、Cry4Ba、Cry8Ea、Cyt2Aa、Cyt2Ba、VIP3A等。从Bt杀虫蛋白三维结构图分析，发现不同类型的杀虫蛋白内部成员之间三维结构具有高度的相似性，例如，所有3D-Cry蛋白都由α螺旋或β折叠组合形成的3个Domain组成，而且不同成员之间每一个结构域内部的二级结构的数量和排列顺序非常保守。

      3D-Cry杀虫晶体蛋白发现最早、杀虫机理研究最透彻、在生物制剂和植物基因工程领域中应用最广，并已在生产应用中取得了巨大的社会、经济和生态效益。

3、Bt杀虫晶体蛋白的结构及进化

　　对已获得的3D-Cry蛋白家族X-ray结构研究结果表明，3D-Cry蛋白家族的三维结构典型特征是含有明显能区分出来的三个Domain，即Domain I、Domain II、Domain III。Domain I由7个α螺旋组成，是杀虫蛋白发挥功能的主要区域，参与了杀虫蛋白低聚物形成和插入细胞膜形成穿孔导致细胞死亡的过程，其中第1、3、4和5个α螺旋在发挥功能起到最关键作用。已有的研究表明:第1个α螺旋是启动杀虫活性的部位，当第1个α螺旋被切除后，杀虫蛋白低聚物开始形成，并插入细胞膜导致跨细胞膜穿孔。第3个α螺旋是不同杀虫蛋白亚基相互结合形成低聚物的区域。第4和5个α螺旋形成发卡（hairpin）结构，是杀虫作用的具体执行区域，主要功能是杀虫蛋白形成低聚物的结合点也是插入细胞膜形成跨膜穿孔的区域。Domain II由β折叠组成3个loop环，主要参与杀虫蛋白与受体结合。Domain III由β折叠组成轮状拓补结构，主要参与杀虫蛋白与受体的识别，是Bt Cry蛋白识别不同害虫的主要功能区域，Domain II和Domain III共同决定靶标害虫的类型。3D-Cry蛋白家族成员之间虽然氨基酸序列不同，但是在三维结构上相对保守，表明该家族所有成员具有相似的杀虫机制。

　　自Bt生物制剂Sporeine问世以来，科学家对3D-Cry杀虫晶体蛋白杀虫机理进行了多方面的探索。最初猜测其对鳞翅目害虫毒杀作用的活性成分是生物制剂中传播的病原菌，但是将病原菌直接注射进入幼虫体内后并没有导致幼虫死亡，说明导致昆虫死亡的并不是病原菌。随着不断地深入研究，科学家们发现将生物制剂中含有伴孢晶体的苏云金芽孢杆菌的孢子饲喂鳞翅目幼虫后，刚摄入细菌孢子就会破坏鳞翅目幼虫中肠刷状缘细胞纤毛，随后导致细胞发生肿胀并裂解，中肠道内的苏云金芽孢杆菌的孢子进入昆虫体内开始发育繁殖细菌，一旦在昆虫体内营养耗尽细菌即产生孢子释放出去，通过附着于植物昆虫取食部位继续寻找下一个宿主，随后研究发现导致幼虫中肠刷状缘细胞纤毛发生肿胀并裂解，是由于孢子内存在的晶体蛋白引起的。同时，研究还发现Bt蛋白要发挥作用需要两个关键的因素将其在昆虫肠道内激活：昆虫肠道碱性环境和特定的蛋白酶（切割杀虫蛋白前体形成活性杀虫蛋白）。一旦杀虫蛋白被激活就会与刷状缘膜上的受体结合形成肠道细胞穿孔，导致肠道上皮细胞发生裂解。体外实验也证明了杀虫蛋白前体必须在碱性环境下被特定蛋白酶切割激活并与受体结合才能发挥作用。

　　自然界中，由于在Bt菌对靶标昆虫具有特异的毒杀作用，导致靶标昆虫为了生存而产生一些突变来抵抗Bt菌的毒杀，最终导致对Bt菌产生抗性。为了适应靶标昆虫的进化，Bt菌体内杀虫蛋白尤其是3D-Cry蛋白家族也在不断发生突变，从而维持对靶标害虫的杀虫活性。通过3D-Cry蛋白家族系统进化分析表明该家族成员的进化主要有两个途径：即三个结构域的独立突变和不同杀虫蛋白之间Domain III的交换。三个结构域的独立突变主要是不同的结构域内部发生氨基酸突变，不同结构域之间的突变互不影响，该途径突变最终导致新杀虫蛋白不断的产生，是新杀虫蛋白不断的产生地主要途径。Domain III是3D-Cry蛋白与受体蛋白的识别区域，是决定靶标的主要功能区域，不同杀虫谱3D-Cry蛋白之间通过交换Domain III结构域可以增加杀虫蛋白的杀虫谱，发生交换的杀虫蛋白Domain III的氨基酸序列具有高度的相似性。例如Cry8Ca和Cry1Jc；Cry1Bd和Cry1Ac；Cry1Cb，Cry1Eb和Cry1Be；Cry8Aa，Cry1Jb，  Cry1Ba和Cry9Da等。此外，据报道通过人工交换不同杀虫蛋白之间Domain III构建的融合Cry蛋白可以提高杀虫蛋白的杀虫效率，例如通过交换Cry1Ab 和Cry1C的Domain III构建了一个新的Cry蛋白(1Ab-1Ab-1C)，该蛋白对甜菜夜蛾幼虫的杀虫活性比单纯Cry1Ab和Cry1C杀虫活性高出十倍以上。最新报道表明，通过交换不同杀虫蛋白之间的Domain III可以扩大杀虫谱，将Cry3Aa的Domain I和II与Cry1Ab的Domain III融合获得的新蛋白能够对玉米根萤叶甲产生毒杀作用，而Cry3Aa和Cry1Ab对其没有活性。

4、3D-Cry杀虫晶体蛋白杀虫机理

       3D-Cry杀虫晶体蛋白对鳞翅目、双翅目、鞘翅目等昆虫具有特异的毒杀作用，通过对大多数3D-Cry杀虫晶体蛋白杀虫机理研究发现，细胞膜形成穿孔途径是杀虫蛋白毒杀昆虫的主要途径。一般包含三个步骤：杀虫蛋白前体中核心杀虫蛋白的释放、核心杀虫蛋白与昆虫肠道表皮细胞表明受体蛋白的识别和细胞发生生理生化反应引起组织细胞形成穿孔导致昆虫死亡

4.1 3D-Cry杀虫晶体蛋白对鳞翅目昆虫的毒杀作用

　　关于3D-Cry蛋白对鳞翅目昆虫毒杀机制的研究不仅多、而且十分透彻。以玉米螟为例，玉米螟幼虫饲喂研究发现，Cry1A类3D-Cry杀虫蛋白在伴孢晶体中是以杀虫蛋白前体的形式存在的，不具有任何杀虫活性。只有在昆虫肠道的碱性环境条件下，在碱性蛋白酶的作用下使杀虫蛋白发生水解，将核心杀虫蛋白释放出来，才具有了杀虫活性。。通过饲喂研究，发现了两种类型的杀虫蛋白前体：大分子量的杀虫蛋白前体Cry1Aa，分子量约130kD；小分子量杀虫蛋白前体 Cry2Aa，分子量约70kD左右。大分子量杀虫蛋白前体需要碱性蛋白酶切除C末端约一半的氨基酸残基和位于N末端的20~50个氨基酸残基才能被激活，而小分子量杀虫蛋白前体的激活仅需对N端的氨基酸残基进行切割。核心杀虫蛋白激活后，通过与昆虫肠道表皮细胞受体之间复杂的互作过程、最终与膜结合并插入和形成穿孔或者通过信号转导使昆虫细胞凋亡。

　　据报道，3D-Cry杀虫晶体蛋白在穿孔形成过程中，对鳞翅目靶标昆虫具有很特异的选择性，这主要取决于昆虫中肠道内壁细胞表面受体与杀虫蛋白能否互相特异性识别并结合，即生物体内有没有供杀虫蛋白识别的受体。没有受体，杀虫蛋白就不能发挥作用，即对该生物不具有毒性。

　　鳞翅目害虫体内含有的 3D-Cry 晶体杀虫蛋白（Crystal，Cry）特异识别受体主要包括：1）类钙粘蛋白（Cadherin）、2）氨肽酶（APN）、3）碱性磷酸酶（ALP）、4）糖脂类受体等。其中钙粘蛋白是最重要的蛋白受体，在杀虫蛋白特异识别靶标害虫并杀死害虫的过程中发挥重要的作用。

　　研究表明，在鳞翅目昆虫Manduca sexta、Bombyx mori、Heliothis Virescens、Helicoverpa armigera、  Pectinophora gossypiella和Ostrinia nubilalis等6个物种体内都发现了供Cry1A杀虫蛋白识别的钙粘蛋白受体。这些钙粘蛋白受体均属于钙粘蛋白家族内的类钙粘蛋白亚家族，含有由11~12个钙粘蛋白重复结构域（cadherin repeats，CR）组成的胞外结构域、一个跨膜结构域和一个胞内结构域。而在以上六个物种中Cry1A杀虫蛋白识别的氨肽酶类受体至少属于五个不同的亚家族。在H.virescens和M.sexta中发现碱性磷酸酶也是Cry1A识别的受体，在L.dispar中还发现Cry1A能识别一个270kD的糖脂类受体。此外，通过应用2D SDS-PAGE电泳等蛋白质组学研究技术研究发现，在M.sexta和 H.virescens中肠刷状缘蛋白中的ATPase亚基A和肌动蛋白也能与Cry1Ac识别结合，但是机理尚不明确。尽管对于Cadherin、APN和ALP与Cry1互作的动力学参数并不明确，但是一般认为Cry1类蛋白与类钙粘蛋白受体有着较高的亲和性，例如在烟草夜蛾中，Cry1Ab与钙粘蛋白受体有着1nM的结合效率，而与APN和ALP有着较低的结合效率，其结合效率远大于100nM。因此，将与杀虫晶体蛋白具有较高亲和性的类钙粘蛋白等受体称为一级受体，而将与杀虫晶体蛋白具有较低亲和性的APN和ALP称为二级受体。关于Cry杀虫蛋白与不同受体识别结合顺序，普遍认为Cry杀虫蛋白首先与钙粘蛋白识别结合，然后与其它受体识别结合。也有报道表明，在玉米螟、烟草夜蛾和蚱蝉中，激活的Cry1Ab Domain II和Domain III首先识别结合高剂量、低亲和力的受体蛋白ALP和APN，这些识别结合主要发生在昆虫中肠细胞纤维膜上，初步识别结合之后的核心杀虫蛋白通过暴露出来的 Domain II的Loop环（包括Loop a-8、2和Loop3），然后再与高亲和力的钙粘蛋白结合。

　　研究还发现，ALP在玉米螟1龄幼虫中表达量高，在4龄、5龄幼虫中表达量较低，而ANP刚好相反，推测玉米螟幼虫肠道受体碱性磷酸酶ALP比氨肽酶ANP作用更大一些，玉米螟1龄幼虫对Cry蛋白具有较高的敏感性也表明高表达的ALP在多聚体杀虫蛋白发挥作用过程中有着重要的意义。

　　但是，不论3D-Cry杀虫蛋白首先与哪一类受体蛋白识别结合，3D-Cry杀虫蛋白最终都必须与钙粘蛋白受体发生识别和结合并形成低聚物，该过程在杀虫蛋白杀虫功能中发挥重要作用。核心杀虫蛋白与钙粘蛋白受体结合后，钙粘蛋白水解去掉核心杀虫蛋白N端Domain I的第一个α螺旋（helixα-1），使核心杀虫蛋白之间的亲和力增大并且相互聚集，最终形成由单体聚合形成的核心杀虫蛋白低聚物。低聚物的形成也大大提高了核心杀虫蛋白与ALP、APN和GPI等二级受体的亲和力，大约增加了200倍以上，导致了二级受体与钙粘蛋白和3D-Cry杀虫蛋白低聚物复合体结合。然后在一、二级受体蛋白的牵引下，3D-Cry杀虫蛋白低聚物Domain I的第 4、5个α螺旋插入细胞膜，使昆虫肠壁细胞膜形成穿孔形成发生裂解。据报道，鳞翅目昆虫棉铃虫体内的类钙粘蛋白发生突变后，能够对Cry1Ab和Cry1Ac产生抗性。对抗性幼虫中肠刷状缘细胞表面的生化检测表明，虽然杀虫蛋白能够与肠壁细胞受体识别结合，但是杀虫蛋白以单体形式存在，不能形成低聚物插入细胞膜。利用基因工程技术去掉Cry1Ab和Cry1Ac的第一个α螺旋后，杀虫蛋白恢复了对钙粘蛋白发生突变的抗性棉铃虫的毒杀作用，杀虫蛋白在抗性昆虫肠壁细胞膜上以低聚物的形式存在。以上结果证明了在3D-Cry蛋白穿孔形成杀虫过程中，钙粘蛋白不仅发挥着受体功能，还执行水解3D-Cry蛋白Domain I第一个α螺旋的功能。只有3D-Cry蛋白Domain I第一个α螺旋发生水解后，3D-Cry蛋白单体才能够形成低聚物插入昆虫肠壁细胞的细胞膜。有报道表明将玉米螟的钙粘蛋白与 Cry1Ab一起饲喂昆虫幼虫后可以提高杀虫效率，后来证明其原因主要是钙粘蛋白提高了水解杀虫蛋白 Domain I的第一个α螺旋的效率，最终加速了低聚物形成。

　　通过对Cry1Ab Domain I氨基酸进行点突变，证明了低聚物的形成也是Cry1Ab核心杀虫蛋白发挥作用的关键步骤之一。例如 Domain I第3个α螺旋是形成低聚物的主要区域，当第3个α螺旋的一个氨基酸残基发生突变时，就会阻碍核心杀虫蛋白低聚物的形成，最终导致杀虫蛋白丧失杀虫活性。通过对玉米螟的研究还发现，杀虫蛋白第4个α螺旋或者第5个α螺旋的氨基酸残基发生点突变后，杀虫蛋白也丧失了活性，但是杀虫蛋白能够形成低聚物，证明了第4个α螺旋和第5个α螺旋与低聚物形成无关但是决定低聚物插入细胞膜的能力。将第4个α螺旋突变的Cry1Ab杀虫蛋白和野生型Cry1Ab杀虫蛋白混合后，使野生型的杀虫蛋白完全丧失了活性，证明突变的Cry1Ab杀虫蛋白与野生型杀虫蛋白形成异常低聚物，丧失了插入细胞膜的功能。SDS-PAGE电泳表明，Cry1Ab核心蛋白低聚物为四聚体，电子显微镜观察也证明Cry4Ba和Cry1Ab低聚物为四聚体。最近也有报道表明，Cry4Aa的核心杀虫蛋白低聚物为三聚体，由 domain I的第4和5 α螺旋组成的三个发卡结构插入细胞膜并形成穿孔。以上研究进一步证明了Cry核心杀虫蛋白要发挥杀虫活性，必须有正确的 Domain I第1~5个α螺旋参与，当第一个α螺旋切除后，可以促进不同的Cry蛋白单体之间通过第3个α螺旋聚合形成低聚物，最后将低聚物内部各个单体的第 4、5个α螺旋组成的通道插入细胞膜形成穿孔。

4.2杀虫晶体蛋白对双翅目昆虫的毒杀作用

　　蚊子是人类登革热、黄热病和疟疾的重要传播载体，利用Bt菌株和3D-Cry杀虫蛋白毒杀蚊子来预防其对疾病的传播已经取得了显著的成果。通过对3D-Cry杀虫蛋白毒杀蚊子机理的研究发现，3D-Cry蛋白也是形成穿孔。目前已经发现了多个3D-Cry蛋白对蚊子都有毒杀作用，例如Cry1、Cry2、Cry4、Cry11和Cry29等。同时还发现了一个对蚊子高致死率的 Bt 菌株即Bt以色列变种（B.t var israelensis，Bti），Bti对登革热和黄热病的载体埃及伊蚊具有高的致死率，对库蚊属也有较高的致死率，而对疟疾载体疟蚊具有较低的致死率。Bti产生的晶体蛋白主要包含Cry4Aa、Cry4Ba、Cry11Aa和Cyt1Aa，这四种杀虫蛋白在毒杀蚊子过程中表现为协同作用。Cyt1Aa主要功能是对其他三类蛋白起着增效作用，同时也防止库蚊属蚊子对Cry杀虫蛋白产生抗性。已有报道表明，在埃及伊蚊、冈比亚按蚊、四斑按蚊和白足按蚊分离获得了蚊子的Cry杀虫蛋白受体。埃及伊蚊和冈比亚按蚊的受体为钙粘蛋白，分别与Cry11Aa和Cry4Ba识别结合。在埃及伊蚊中钙粘蛋白也是来源于Bt.var jegathesan Cry11Ba的受体，但是与Cry4Ba亲和力较低。Cry4Ba能识别和结合冈比亚按蚊中的钙粘蛋白片段，与Cry4Ba混合后能够增强 Cry4Ba 对埃及伊蚊和冈比亚按蚊的杀虫效率，同时埃及伊蚊的钙粘蛋白抗体能够在其刷状缘微囊中与Cry11Aa竞争结合钙粘蛋白，证明了钙粘蛋白也是蚊子体内的主要受体蛋白。

　　在埃及伊蚊和冈比亚按蚊体内也发现了APN和ALP等受体，并能与Cry4Ba、Cry11Aa和Cry11Ba 结合。2009年，Fernández 等分离获得了一个Cry11Aa的受体ALP1，该蛋白含有两个Cry11Aa Domain III结合位点 561RVQSQNSGNN570和一个Domain II第8个α螺旋结合位点，也有报道表明，ALP1能与Cry4Ba和Cry11Ba结合，ALP也是冈比亚按蚊中Cry11Ba的受体蛋白。在埃及伊蚊中发现了两种Cry11Aa的APN受体和AaeAPN2。原核表达的两种 APN 蛋白能够抑制Cry11Aa与刷状缘囊泡结合，证明APN是Cry11Aa埃及伊蚊肠道细胞膜的主要受体。在冈比亚按蚊和四斑按蚊中也都发现了两种Cry11Ba的APN受体，Cry11Ba对冈比亚按蚊和四斑按蚊中的APN受体有较高的亲和力，分别达到0.56 nM和6.4 nM，以上结果证明，APN在两个蚊属物种Cry11Ba的毒理学功能中发挥着重要的作用。

　　最新研究表明，与钙粘蛋白肽段功能一样，冈比亚按蚊APN蛋白肽段也能增强Cry11Ba的杀虫蛋白活性。对鳞翅目、双翅目和鞘翅目中已经报到的Cry杀虫蛋白受体蛋白进行统计分析，发现不同昆虫具有相似的受体蛋白，表明3D-Cry晶体蛋白对所有靶标害虫有着相对保守的作用模式。与鳞翅目害虫需要钙粘蛋白结合形成低聚物然后与 ALP、APN等锚锭受体结合插入细胞膜使细胞形成穿孔的模式不同，双翅目中一些害虫3D-Cry杀虫蛋白可以直接与ALP、APN等受体结合发挥功能。有报道表明，Bti杀虫蛋白毒理学作用过程中最主要的特征就是4种杀虫蛋白之间的协同作用，通过对Cyt1Aa 氨基酸序列点突变，证明了Cry4Ba和Cry11Aa通过domain II的Loop环与Cyt1Aa结合形成复合体并参与和受体蛋白的互作。以上结果也表明，Cyt1Aa的功能主要是Cry4Ba和Cry11Aa的替代受体，例如，将Cry11Aa与Cyt1Aa混合，它们能够形成250KD的聚合物，该聚合物完全能够在细胞膜中形成穿孔，因此可以推测Cyt1Aa的功能与钙粘蛋白受体促进杀虫蛋白形成低聚物的功能相类似。

4.3 3D-Cry杀虫晶体蛋白对鞘翅目昆虫的毒杀作用

　　据报道，鞘翅目昆虫大黄粉虫（Tenebrio molitor）、玉米根萤叶甲（Diabrotica virgiferavirgifera）、蔬菜花斑虫（Leptinotarsa decemlineata）和苜蓿叶象甲（Anthonomus grandis）等能够被3D-Cry杀虫晶体蛋白毒杀，而且毒杀途径也是形成穿孔。对大黄粉虫中分离获得的钙粘蛋白进行研究发现，其能够促进Cry3Aa低聚物的形成。此外，通过给大黄粉虫饲喂dsRNA沉默钙粘蛋白基因，发现害虫对Cry3Aa产生抗性，证明了大黄粉虫中钙粘蛋白也是Cry3Aa的受体蛋白，对Cry3Aa的杀虫活性也具有激活作用。通过对玉米根萤叶甲中的钙粘蛋白进行研究，发现钙粘蛋白胞外靠近细胞膜片断与Cry3Aa和Cry3Bb有着较高的亲和力（分别为12和1.4nM）。将玉米根萤叶甲中的钙粘蛋白与Cry3Aa或Cry3Bb混合后饲喂不同鞘翅目昆虫，能够增强Cry3Aa和Cry3Bb对不同鞘翅目昆虫的毒杀效率。此外，饲喂蔬菜花斑虫Cry3Aa蛋白，研究结果发现Cry3Aa受体蛋白为金属蛋白酶ADAM-3（A Disintegrin and Metalloproteinase，ADAM），该蛋白与Cry3Aa的domain II第一个Loop环结合推动细胞穿孔的形成。在鞘翅目害虫中还发现了唯一锚锭蛋白受体苜蓿叶象甲中的ALP，该受体可以与Cry1B结合。总之，在鳞翅目、双翅目和鞘翅目三个不同种类的害虫中分离获得了相似的3D-Cry杀虫蛋白受体，结合大部分 3D-Cry 杀虫蛋白具有相似的空间结构域，可进一步推测 3D-Cry 杀虫蛋白在毒杀不同种类的靶标害虫过程中，可能具有相似的杀虫机理。

5、昆虫对Bt Cry杀虫蛋白抗性

　　由于Bt杀虫蛋白对靶标害虫群体的生态选择压和昆虫体内的特定受体，为昆虫不断进化而产生抗性后代提供了极大的概率。1985年，首次报道了印度谷螟对稻谷Bt孢子杀虫剂产生了抗性，经过研究发现实验室条件下给印度谷螟连续饲喂亚致死量孢子杀虫剂15代后就会出现抗性种群。1997年，在夏威夷种植的豆瓣菜喷施Bt杀虫剂400倍以上时，出现了野生小菜蛾抗性群体。在实验室条件下，通过给昆虫饲喂Cry杀虫蛋白已经人工筛选出了多个抗性昆虫种群（自然条件下野生型没有产生抗性），进一步证明了长期大量使用一种Cry蛋白必定会导致抗性昆虫的产生。

　　目前为止，自然条件下共发现了三个鳞翅目害虫对Bt制剂产生了抗性，分别是印度谷螟、小菜蛾和粉纹夜蛾。同时，还报道了四起昆虫对Bt转基因农作物产生抗性的事件：在美国，棉铃虫对Cry1Ac的抗虫棉产生了抗性；在波多黎各，斜纹夜蛾对Cry1F转基因玉米产生抗性；在南非，玉米楷夜蛾对Cry1Ab玉米产生抗性；在印度棉红铃虫对Cry1Ac转基因棉花产生抗性。

　　利用在实验室条件下筛选获得的Bt抗性昆虫群体进行研究，发现了多种引起昆虫对杀虫蛋白产生抗性的机制，例如，由于钙粘蛋白等受体发生突变，使Cry杀虫蛋白不能水解去掉Domain I第一个α螺旋并形成低聚物，从而无法完成毒杀过程。此外，通过运脂蛋白或酯酶来隔离杀虫蛋白、通过提高对杀虫蛋白的免疫反应、通过改变杀虫蛋白受体减少杀虫蛋白Domain II和Domian III与昆虫肠道细胞膜识别结合等等。目前为止，普遍认昆虫对杀虫蛋白产生抗性机制

　　为是通过突变杀虫蛋白受体蛋白而减少毒素蛋白与昆虫中肠细胞的结合，这些受体包括钙粘蛋白、碱性磷酸酶和氨肽酶等，不同种类的害虫突变的受体蛋白也不相同。最近有报道表明，ABC转运蛋白发生突变能够引起烟芽夜蛾对Bt产生抗性，该蛋白主要影响Cry1A与中肠涮状缘囊泡膜结合，推测ABC转运蛋白可能是Cry1A的一个新的受体蛋白参与了杀虫蛋白低聚物插入细胞膜的过程。

　　科学家们将Bt蛋白发生高频抗性的模式归纳为“抗性模式一”，该模式的典型特征就是对Cry1A产生抗性并且对Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac产生交叉抗性，在多个鳞翅目抗性昆虫中研究发现“抗性模式一”是由于靶标昆虫钙粘蛋白基因发生突变引起的。

6、Bt Cry杀虫蛋白在转基因作物中的应用

6.1 转 Bt Cry 杀虫基因作物商业化概况

      1987年，比利时一公司首次报道了转Bt Cry基因烟草和蕃茄研制成功。但在早期的研究中发现，使用不加任何修饰的Bt基因，导致Bt Cry杀虫蛋白在转基因植株中表达量很低，起不到杀虫的作用。后来研究发现，Bt Cry杀虫蛋白低表达的原因主要是原核生物和真核生物基因存在着差异，例如基因GC含量、密码子偏爱性等。此外，细菌基因中存在较多的ATTTA序列容易成为植物mRNA合成的终止信号。1991年，Perlak等对源自原核生物的Bt基因进行了修饰和改造，通过将人工优化过的Cry1Ab和Cry1Ac基因导入植物中，使Cry杀虫蛋白表达量提高了100倍，Cry杀虫蛋白表达量占植物可溶性蛋白总量的0.02%。美国和法国科学家对Bacillus thuringiensis var Kurstaki HD-73菌株Cry1A的N端杀虫蛋白部分进行优化，利用35S启动子驱动该基因在烟草中表达，大田实验证明获得的转基因植株能够有效防治美洲棉铃虫的危害。

　　随着植物基因工程技术的不断积累，一些新的技术应用大大提高了Cry杀虫蛋白在植物中的表达量。例如在构建植物表达载体过程中中引入了强启动子、增强子、强终止信号以及异源intron等元件后，转基因植物中杀虫蛋白表达量可以提高至植物可溶性蛋白的0.2~1%。而通过叶绿体转化技术，将Cry基因表达载体导入叶绿体后，Bt Cry杀虫蛋白表达量可以增加至植物可溶性蛋白的5%。当前，利用以上技术已经获得了多种含有不同外源基因的转基因农作物，并且得到了大面积的商业化生产应用。

6.2 国外转Bt Cry基因作物商业化概况

　　国外转基因农作物研究起步早，商业化应用时间也比较早，上个世纪80年代末至90年代初研制成功并且获得了商业化。依据利用的杀虫蛋白基因种类、转基因作物中多个外源基因聚合方式和转基因作物中杀虫蛋白基因的拷贝数的不同，可以将国外研制的转基因农作物划分为两代。

　　第一代转Cry杀虫蛋白基因农作物典型特征是：转基因材料含有一个抗虫基因，或者通过杂交聚合的方式使一个转基因材料同时获得抗虫、抗除草剂等多种抗性基因。第一代转基因农作物主要有抗虫棉花、抗虫烟草、抗虫马铃薯、抗虫玉米、抗虫抗除草剂棉花等，其中大面积商业化转Cry杀虫蛋白的作物主要抗虫棉、抗虫玉米、抗虫抗除草剂棉花等。

       1991年将Cry3A导入马铃薯后，转基因马铃薯对马铃薯甲虫的杀虫效率表现出明显高于商业化的Cry3A生物制剂的优势，体现出了巨大的商业价值，随后转杀虫蛋白基因的棉花、玉米和水稻也相继问世。1995年美国环境保护署（Environmental Protection Agency，EPA)正式授权第一个转基因马铃薯、玉米和棉花商业化。首先商业化的是孟山都公司的转Cry3A的NewLeaf马铃薯；其次是先正达公司的KnockOut和Mycogen公司的NatureGard两个用于防治欧洲玉米螟的转Cry1Ab的玉米杂交种；之后商业化的抗虫农作物是：孟山都公司转人工改造的Cry1Ac基因的抗虫棉品种Bollgard 和Ingard；Northrup King公司和孟山都的转Cry1Ab的Bt抗虫玉米品种Agrisure和YieldGard。1998年，美国环保总署又授权了转Cry1Ac的转基因马铃薯商业化。2001年，先锋种业和Dow AgroSciences公司推出了转Cry1F的转基因玉米Herculex，主要用于防治小地老虎(Agrotis ipsilon)、草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）和欧洲玉米螟。

　　随着第一代抗虫农作物的大面积种植，杀虫蛋白对靶标害虫的选择压增大，加之杀虫蛋白基因单一，最终导致对转基因作物表现出抗性的害虫产生。2002年，NewLeaf马铃薯、NewLeaf Plus、Bollgard、Ingard、早期转基因玉米品种等逐渐被市场淘汰，取而代之的是一些更有商业价值的新产品。这些新产品在汲取第一代转抗虫基因作物缺陷的基础上产生的第二代转Cry杀虫蛋白农作物，其特征是将两个具有不同杀虫谱的Cry杀虫蛋白基因导入同一作物，或将两个杀虫蛋白基因与其他抗性的基因共同转化作物，使转基因作物同时含有多个外源基因；也可以通过杂交聚合的方式将多个Cry杀虫蛋白基因聚合，使转基因作物含有多个杀虫蛋白基因。第二代Cry杀虫蛋白基因主要是Cry1Ac和Cry2Ab等，获得的转基因农作物主要有抗虫棉、抗虫玉米等。主要代表材料有：2002年孟山都推出的同时表达Cry1Ac和Cry2Ab两个抗虫基因的抗虫棉新品种Bollgard II，以及转化人工修饰后的cry3Bb1基因用于防治玉米根虫（Diabrotica virgifera）的抗虫玉米YieldGard Rootworm；2003年，通过将两个不同的转基因材料进行杂交选育出了一个玉米新品种YieldGard Plus，其体内存在Cry1Ab1和Cry3Bb1两个基因，此外，还有一些通过杂交聚合获得的抗虫抗除草剂农作物。

6.3我国转Bt Cry基因作物商业化概况

　　我国转Bt基因农作物研究起始于上世纪90年代初，第一个获得产业化的转Bt基因农作物是由在中国农业科学院生物技术研究所郭三堆研究员研制的转Bt基因抗虫棉，即中国第一代转Bt基因抗虫棉也称为单价抗虫棉，其抗虫性在90%以上，减少用药60%~80%，增产30%~40%，1997年至2003年得到了大面积的推广应用。为了增加抗虫基因的抗性和杀虫谱，2003年，郭三堆研究员又研制成功第二代转基因抗虫棉，它含有Bt基因和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（Cpti）两个抗虫基因。2005年，经过多年的研制，郭三堆研究员建立了优质、高产、抗虫三系杂交棉育种平台，并选育出我国第一个抗虫三系杂交面新品种银棉2号，使我国转基因抗虫棉研究技术居国际领先地位。之后为了提高抗虫基因的表达协同性，将Bt基因和豇豆胰蛋白酶抑制剂基因（Cpti）融合后共用一个表达盒导入棉花进行表达，该技术已经获得了国家专利局颁发的专利证书。经过近20年的研发和产业化，我国抗虫棉的种植面积占棉花总种植面积的80%以上。其中，国产抗虫棉种植面积占转基因棉花总面积的95%以上。此外，我国其它农作物如水稻、玉米等也先后获得了转Bt基因新品种。例如，1998年，华中农业大学张启发教授成功研制了一系列的转Bt基因（Cry1Ab/Cry1Ac基因）水稻，且于2007年进行了大规模的田间试验。2009年12月中国农业部为其颁发了转基因植物生物安全性评价证书，获准其产业化。目前在我国林木类植物也相继获得了一些转Bt基因的材料，如转Bt基因杨树、绿化植物等。

6.4转Bt Cry基因作物种植面积及取得的效益

　　自从转Bt杀虫蛋白基因作物问世以来至上个世纪末，世界范围内相继有二十多个国家和地区开始种植转Bt基因的农作物。而近10年来随着转Bt杀虫基因农作物的不断推出和种植面积的持续上升，除欧洲之外，几乎全球所有的陆地都种植了转Bt杀虫基因农作物。据统计，2009年全球转Bt基因农作物种植总面积超过了5亿公顷，占全部转基因农作物种植面积的36%。其中2.17亿公顷种植了只含有Bt基因的转基因农作物，2.87亿公顷种植了转抗除草剂基因和Bt杀虫基因的农作物。美国是转Bt基因作物种植面积最大的国家，其次是印度、阿根廷、巴西和中国。

　　尽管转Bt Cry基因作物对环境的影响在政府和公众之间存在较大的争议，但是Bt杀虫基因农作物产生的巨大生态效益却得到了广泛的认可。发展Bt农作物不仅可以减少农药使用量节约喷施农业所用的石油燃料，也可以通过鼓励实施免耕法种植转基因作物来减少CO2排放量和保护土壤及水分流失。此外，大面积种植转Bt蛋白基因农作物，不仅减少了喷施农药的次数（从每生长季16次降低至2~3次），而且减少了使用农药引起的中毒事件，结合作物增产10%带来的经济效益使农民增收多达40%以上，取得了巨大的经济、社会、生态效益。通过监测农药环境影响指数（environmental impact quotient，EIQ)发现，1996~2008年种植转基因作物共减少农药使用量35.5万吨（占总农药使用量的8.4%）。仅2008年一年就减少农药使用量3.46万吨（占总农药使用量的9.6%），在整个生态网络中农药环境影响指数降低了18.2%。