阙延福1，胥贤2，徐念1，黄晋3，李伟涛1，熊美华1，李红涛2，朱滨1*

(1.水利部中国科学院水工程生态研究所，水利部水工程生态效应与生态修复重点实验室，湖北 武汉 430079； 2.武汉中科瑞华生态科技股份有限公司，湖北 武汉 430080； 3.中国水电建设集团圣达水电有限公司 安谷水电站鱼类增殖放流站，四川 乐山 614013)

摘要:为进一步研究基于标记的唇鱼骨Hemibarbus labeo苗种放流效果评估工作，以安谷水电站鱼类增殖放流站实际工作中的两个唇鱼骨家系为研究对象，采用6个多态性微卫星标记对两个唇鱼骨家系开展了亲子关系鉴定分析。结果显示：6个微卫星标记共检测出37个等位基因，观测杂合度和期望杂合度分别为0.361～0.952(平均值为0.776)和0.302～0.795(平均值为0.589)；多态信息含量为0.262～0.767(平均值为0.526)；Cervus软件分析显示，在双亲均未知的情况下，唇鱼骨6个微卫星位点的累计非亲权排除率(CEP)为99.09%；两个家系中的72个子代个体，正确分配到对应家系父母本(12个亲本)的总体比例为95.83%。研究表明，本研究中采用微卫星标记方法来开展唇鱼骨家系亲子鉴定的分析，可为唇鱼骨的增殖放流效果评估提供技术支撑。

关键词: 唇鱼骨；微卫星；亲子鉴定；累积非亲权排除率；增殖效果评估

唇鱼骨Hemibarbus labeo隶属于鲤形目Cypriniformes、鲤科Cyprinidae、鮈亚科Gobioninae、鱼骨属Hemibarbus Bleeker，除中国西部高原地区以外，在国内各大水系均有分布，尤其在四川境内的金沙江和大渡河水域种群数量相对较多，是当地一种重要的淡水经济鱼类[1]。大渡河是长江上游的二级支流、岷江的最大支流，其干流水量丰沛，径流稳定，是国家规划的十三大水能开发基地之一。近年来，由于水利工程建设相对集中，大渡河流域适宜生境萎缩严重，加之水域环境恶化、过度捕捞等人类活动的影响，包括唇鱼骨在内的鱼类资源量急剧减少[2]。为保护和利用这一种经济鱼类，人工增殖放流成为众多保护措施的首选。大渡河安谷鱼类增殖放流站就是基于保护安谷水电站影响范围内鱼类资源而建设的繁育场，唇鱼骨是该站最主要的放流种类，年放流量达到12万尾，约占鱼类放流总数量的40%。

自2016年以来，为恢复与补充大渡河安谷河段鱼类资源，安谷增殖放流站已经实施了多次人工增殖放流。由于放流鱼类数量较大，工作中如果完全采用物理和化学标志(如T型标、金属线标或荧光标记等)对放流的唇鱼骨苗种实施逐尾标记，其标记周期长，工作量较大，鱼类个体致死率将较高，难以在实际工作中实施。另一方面，物理和化学标志存在一定比例的脱落和失效情况，加之持续性的标记回捕和跟踪监测工作也比较缺乏，因此，现阶段采用的标记技术不能较明确地区分放流个体和野生个体，也难以较准确判断唇鱼骨人工放流苗种对野生资源的补充效果。

国外长期实施鱼类资源增殖放流的经验表明，增殖放流效果的评价必须依赖能准确区分放流群体和野生群体的鱼类标记来实现[3]。鱼类标志主要分为物理标志、化学标志和遗传标记3大类。对于大规模放流而言，物理标志无法覆盖所有放流苗种，化学标志存在对苗种伤害大、标志存留时间较短等局限，无法开展大规模应用[4]。遗传标记基于自身携带的内在基因，以其覆盖面广、标记长期存在、对苗种几乎无伤害，以及基于遗传学孟德尔规律易区分等优点，逐步被应用于鱼类放流效果评估中。近十年来，随着遗传标记和生物统计学分析的深入发展，基于微卫星标记的亲子鉴定技术正成为国内外鱼类增殖放流效果评估的主要手段之一[5-9]。

目前，基于标记的唇鱼骨苗种放流效果评估工作较少，仅有少量唇鱼骨微卫星标记筛选及野生群体遗传多样性方面的研究报道[10-15]。本研究中，以安谷增殖放流站实际放流工作中的两个唇鱼骨家系为研究对象，开展了基于微卫星遗传标记的亲子鉴定技术研究，从标记的判别能力和累计非亲排除概率等方面，初步探讨了唇鱼骨微卫星标记的亲子鉴定可行性，以期为鱼类增殖放流效果评估、谱系调查、育种研究等提供技术支持。

唇鱼骨样品的采样时间为2017年4—6月，亲本和子代均来自大渡河安谷鱼类增殖站。共采集两个家系，其中，家系1由1尾雌性个体(CGF 01)和2尾雄性个体(CGM 01和CGM 02)的配对组成，获得子代个体36尾(编号CG 01～CG 36)，家系2由4尾雌性个体(CGF 02～CGF 05)和5尾雄性个体(CGM 03～CGM 07)的配对组成，获得子代个体36尾(CG 37～CG 72)。家系中的亲本样品来源于唇鱼骨的背鳍(质量约为3 g)，家系中的子代经过脱膜、卵黄退化，孵化养殖7 d后，其全长约为1.5 cm，将个体捞取后浸泡。家系中的亲本个体单独浸泡，子代个体按照家系进行浸泡，所用的浸泡液为分析纯级的无水乙醇。浸泡的亲本和子代样品带回实验室后，于冰箱(-20 ℃)中保存备用。

1.2.1 PCR扩增及电泳检测 按照经典的酚氯仿方法[16]进行家系样品中的亲本和子代DNA提取，基因组DNA经过纯度检测后，稀释至大约50 ng/μL的浓度后，置于冰箱(-20 ℃)中保存待用。PCR扩增体系中使用的微卫星引物来自已发表的相关文献[10, 12]，PCR产物采用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行多态性筛选，最终选择6对多态性较高和条带清晰的微卫星位点开展家系试验(表1)。试验中使用的微卫星位点采用5′端带有荧光的FAM或HEX引物进行标记，在筛选好的温度下进行PCR扩增。PCR扩增体系为：10×Taq Buffer 2 μL，MgCl2 (25 mmol/L)溶液1.2 μL，dNTP混合物 (10 nmol/L) 0.5 μL，正、反向引物各0.5 μL(10 pmol/μL)，Taq酶(5 U/μL) 0.1 μL，DNA模板(50 ng/μL)1 μL，用灭菌双蒸水补足至20 μL体积。PCR扩增程序为：94 ℃下预变性5 min；94 ℃下变性40 s，退火40 s(具体退火温度见表1)，72 ℃下延伸50 s，共进行35个循环；最后再在72 ℃下延伸10 min，最终降温至4 ℃后于冰箱中保存。PCR产物经过ABI 3730XL测序仪进行毛细管电泳后，采用Genemapper V4.1(美国ABI公司软件)读取各样品的等位基因大小。

1.2.2 亲子鉴定分析 经过测序和软件读取后的数据，采用Cervus 307[17]亲缘关系分析软件开展遗传多样性相关参数分析，使用参数主要包括等位基因数Na、观测杂合度Ho、期望杂合度He、多态信息含量(polymorphic information content，PIC)、哈迪温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium， HWE)检测和无效等位基因(null allele)频率。亲子鉴定分析中，先使用Cervus 软件中的模拟(simulation)功能，假设父母本均未知的条件下，模拟运行10 000次，目的是通过比较大量随机后代的似然值LOD(log likelihood ratio)值，得到足量Delta分布；其结果再与每个候选父母本个体的LOD值进行比较，找到可能性最大的候选父母本个体(most-likely parents)，开展亲子鉴定分析[17]。

表1 微卫星位点信息Tab.1 Information of the microsatellite loci

位点(登录号)locus(GenBank accession No.)引物序列primer sequence (5′-3′)重复单元motif repeat退火温度/℃annealing temperaturePCR产物长度/bpsize range荧光引物标记fluorescent labelHemi 04(EF089262)CAACAGTGCTGCAGAAGGAAAGAGCCAACCAGACATACTC(AC)3052287～384FAMHemi 07(EF089265)TCCTCTCTTCACCTCATATCGAGGCTGATGCAATCCACTG(AC)855126～161HEXHL 15ACGGTTCAGTCCAGACCAGCTCACTGACGCTGCAGATTC(GT)1958380～396HEXHL 24(KM018282)ATGGGAGACATGGTGGACATATTCAGGTTTCAGGCCACAC(CA)956157～160HEXHL 41(KM018285)AAGGTCATGGTCGTGGAAACTTAACCCTGAGAACCGTCCA(CA)1556215～228FAMHL 44(KM018286)TCAGCACTTAAAGCAGGAAGGCGACGATCTAGTAATGACCGAGT(CA)1154111～136HEX

本研究中使用的6个微卫星位点均能在唇鱼骨家系样本中获得稳定的PCR扩增产物(图1)，6个微卫星标记在两个家系样本中共扩增出37个等位基因。其中等位基因数最多的位点为HL 15，最少的位点为Hemi 07(表2)。6个位点的观测杂合度为0.361～0.952，平均值为0.776；期望杂合度为0.302～0.795，平均值为0.589；多态信息含量为0.262～0.767，平均值为0.526；哈迪-温伯格平衡检测显示，除位点Hemi 04偏离外，其他位点均符合哈迪-温伯格平衡规律；无效等位基因检测显示，所有位点均未发现存在无效等位基因干扰(表2)。

图1 唇鱼骨微卫星位点代表性分型结果Fig.1 Typical genotype of the microsatellite loci in Hemibarbus labeo

表2 唇鱼骨微卫星标记特征参数Tab.2 Characteristic parameters for the six microsatellite loci in Hemibarbus labeo

位点locus等位基因数 number of allele (Na)观测杂合度 observed heterozygosity (Ho)期望杂合度 expected heterozygosity (He)多态信息含量 polymorphism information content (PIC)哈迪-温伯格平衡检测 Hardy-Weinberg equilibrium (HWE)无效等位基因频率null allele(F)Hemi 0450.9400.6870.638∗-0.1903Hemi 0730.3610.3020.262NS-0.0960HL 15140.8920.7950.767NS-0.0662HL 2440.8570.5050.387NS-0.0643HL 4160.9520.6470.588NS-0.0325HL 4450.6550.5970.512NS-0.0583

注：NS表示未显著偏离Hardy-Weinberg平衡(P>0.05); *表示偏离

Note: NS, no significantly deviated Hardy-Weinberg equilibrium(P>0.05); *, deviated Hardy-Weinberg equilibrium

根据Cervus软件分析结果，在双亲均未知的情况下，6个微卫星位点在家系1亲本及其子代的累积非亲权排除率(combined non-exclusion probability，CEP-Parent Pair)为96.38%(数据未单独显示)，而在家系2亲本及其子代的累积非亲权排除率为99.42%(数据未单独显示)。将家系1和家系2的子代和亲本数据进行合并后分析发现，在双亲均未知的情况下，唇鱼骨6个微卫星位点的累积非亲权排除率(CEP)为99.09%(表3)。该分析结果初步说明，试验中选择的6个具有较高多态性的微卫星位点满足亲权鉴定判别需求最低95%的要求，可用于开展初步的亲权鉴定分析。

采用Cervus对唇鱼骨家系1和家系2开展亲权鉴定分析，发现家系1中的36个个体，除有1个位点错配无法正确分配外，其余35个个体均能正确分配到人工繁殖时对应的父母本，其正确分配到父母本的比率为97.22%(表4)。

家系1中，除了个体CG 11以外，其他个体均能正确对应到母本CGF 01上(表5)。这些个体的共同特点是成对父母本似然率值(pair LOD score)显示为正值，仅有CG 11显示为负值(-5.78)。同时，个体CG 11的分配还发现了其母本似然率值(maternal LOD score)和父本似然率值(paternal LOD score)均为负值(-7.22和-2.76)，其原因是父母本均出现了位点错配所致。

表3 唇鱼骨家系的亲权鉴定参数Tab.3 Paternity analysis of Hemibarbus labeo

位点locus双亲未知时的单亲本非亲权排除率non-exclusion probability for one candidate parent(NE-1P)单亲已知时的另一亲本非亲权排除率non-exclusion probability for one candidate parent given the genotype of a known parent of the opposite sex(NE-2P)双亲未知时的父母本组合非亲权排除率non-exclusion probability for a candidate parent pair(NE-PP)累积非亲权排除率combined non-exclusion probability (CEP)Hemi 040.7310.5560.371Hemi 070.9550.8650.7760.7120HL 150.5660.3880.1970.9434HL 240.8740.8000.6980.9605HL 410.7710.6090.4320.9829HL 440.8150.6860.5340.9909

表4 两个家系中唇鱼骨子代分配到父母本的数量和比例

Tab.4 Numbers and proportions of offsprings which are allocated to the parents in the two pedigrees

家系pedigree子代数量number of offsprings错配个体数量number of mismatched offsprings正确找到父母本的子代数量(比例/%)number and proportion of offspring parentaged assignment to the right parent家系136135(97.22)家系236234(94.44)总体overall72369(95.83)

同样，在家系2中，有2个个体(CG 58和CG 69)因为错配原因无法正确分配到人工繁殖时对应的父母本。家系2所有36个个体中有34个个体能正确分配到对应父母本，其正确分配率为94.44%。

累计家系1和家系2所有个体的分析结果，在两个家系中共计的72个子代个体，实际正确分配到人工繁殖时所对应父母本(12个亲本)的比率为95.83%(表4)。该比率比6个微卫星位点的累计99.09%非亲权排除率略低。

表5 分配错误子代个体的主要参数Tab.5 Main parameters of offsprings which are not allocated to the parents

子代编号offspring ID母本编号maternal candidate ID母本似然率值maternal LOD score父本编号paternal candidate ID父本似然率值paternal LOD score成对父母本似然率值pair LOD scoreCG 11CGF 05-7.22CGM 06-2.76-5.78CG 58CGF 01-2.41CGM 02-2.41-2.12CG 69CGF 01-1.41CGM 01-0.88-2.19

本研究中共使用了6个微卫星位点，分析了唇鱼骨的微卫星位点特征，主要涉及等位基因数、观测杂合度、期望杂合度、多态信息含量等参数。按照Bostein等[18]提出的衡量微卫星位点变异程度高低的评价指标多态信息含量PIC来看，6个位点中有4个位点(Hemi 04、HL 15、HL 41和HL 44)的PIC值均大于0.5，处于高度多态性水平，其余两个位点(Hemi 07、HL 24)的PIC值为0.25～0.50，处于中度多态性水平。总体上，6个位点的平均多态信息含量为0.526，处于高度多态性水平。

在位点的哈迪-温伯格平衡检测方面，位点Hemi 04显示有偏离现象，可能与非随机交配有关。根据Cervus软件的帮助文件显示，该软件在哈迪-温伯格平衡检测的偏离上具有中等程度的容忍度，通常理解为仅具有轻微程度的偏离，尚未达到极显著程度[17]，并不会对本研究结果造成较大影响。

关于微卫星扩增中的无效等位基因现象，主要是由于在一个或多个引物结合点，容易阻止该位点的等位基因进行有效扩增，从而产生无效等位基因，尤其当某一个位点显示偏离哈迪-温伯格平衡的时候[19]。无效等位基因的检测主要通过计算其频率来判断，如果一个位点的无效等位基因频率值为较大正值，通常显示子代基因型大多为纯合子，且部分纯合子与已知父母本存在错配，因此，该位点不能用于亲子鉴定分析。通常无效等位因频率十分接近0，或者有轻微的负值，该负值意味着含有杂合子基因型的个体较多所致[7, 20]。本研究中，微卫星位点的无效等位基因频率检测均符合软件分析需求，未对鉴定结果产生明显影响。另一方面，本研究中使用的6个微卫星位点均为两碱基重复单元，在试验过程中，可能产生结巴带(stutter band)，影响微卫星分型中的判读结果，在今后的研究中可以分离筛选三碱基、四碱基或者复合单元的微卫星位点[21-22]，同时，增加更多微卫星数量，使位点的高度多态性更高、判别能力更强[8]。

亲子鉴定是利用分子遗传学、生物学及法医学的理论和技术判断亲代与子代是否具有亲缘关系，已被广泛应用于各种生物亲缘关系研究中。目前，在亲子鉴定分析中普遍使用的是微卫星分子标记，相对于早期使用的表型标记、谱系登记、血型、蛋白质多态性和同工酶等传统方法，微卫星标记具有方便快捷、遗传稳定和准确度高的特点，是较为理想的分子标记。

亲子鉴定的方法通常包括基于排除概率的排除法和基于似然比的似然法。排除法是最直观有效的方法，其原理是基于孟德尔遗传规律，即子代的基因型一半来自父本，一般来自母本。排除法的基本要求是位点上等位基因不发生错配，而累积非亲权排除率(CEP)是衡量亲子鉴定是否成立的主要参考依据。根据赵桐茂[23]提出的观点，当累积非亲权排除率在99.73%及以上时，就可以认定存在亲子关系；当累积非亲权排除率为99.00%～99.73%时，极有可能有亲子关系；累积非亲权排除率为95%～99%时，有可能存在亲子关系；当累积非亲权排除率为80%及以下时就不能肯定有亲子关系，需要进一步进行检测分析。本研究中，所用的6个唇鱼骨微卫星位点累积非亲权排除率为99.09%，处于极有可能有亲子关系的水平。

基于排除概率的方法，张志和等[24]使用18对大熊猫特异微卫星标记开展了大熊猫繁育研究基地中大熊猫幼子及其母亲和可疑父亲的亲子鉴定，结果显示，排除率大于99.99%。类似研究还在其他种类上开展过，如长江江豚Neophocaena phocaenoides asiaeorientalis[25]、荷斯坦奶牛[26]、大菱鲆Scophthalmus maximus[8]和中华鲟Acipenser sinensis[9]等种类。尽管这些研究结果显示排除概率普遍在95%以上，但仍有极少数个体在个别位点上出现了错配现象，说明排除法仍有一定的局限性，尤其在位点鉴别概率较低的情况下，可能会有多个候选父本或者母本不能被排除[24]。本研究中的2个家系中，共计有3个个体出现了父母本的错配现象，从而导致了位点的分配率下降。

本研究中采用子代的似然值(LOD)开展亲子鉴定的检验，要求LOD值必须大于0，其生物学意义为：在置信区间内无错配位点时，与其他任意父母本相比，该父母本最有可能是子代的亲本[17]。本研究中有3尾个体的LOD小于0，导致无法正确找到人工繁殖家系时对应的父母本，其主要原因就是位点上的等位基因错配造成。

根据家系构建的实际鉴定来看，本研究中使用的唇鱼骨微卫星位点具有较强的鉴别能力，与家系设置的结果基本相一致。基于提高位点鉴别能力考虑，现有的唇鱼骨微卫星数量较少，多态性不高，还需要再筛选一批多态性微卫星位点，以更好地满足增殖放流中回捕个体的鉴别需求，为放流效果评估提供高可信度的技术手段。

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QUE Yan-fu1， XU Xian2， XU Nian1， HUANG Jin3， LI Wei-tao1， XIONG Mei-hua1， LI Hong-tao2， ZHU Bin1*

(1.Key Laboratory of Ecological Impacts of Hydraulic-Projects and Restoration of Aquatic Ecosystem,Ministry of Water Resources, Institute of Hydroecology, Ministry of Water Resources and Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430079, China; 2.Wuhan Sinoeco Ecological Science & Technology Company Limited, Wuhan 430080, China; 3. Breeding and Releasing Station of Fish in Angu Hydropower Station, Shengda Hydropower Company Limited, China Hydropower Construction Group, Leshan 614013, China)

Abstract： In the present study, six polymorphic microsatellite markers were first used in parentage analysis for the two families of Hemibarbus labeo at Angu Proliferation Releasing Station. A total of 37 alleles were obtained, with the observed heterozygosis ranging from 0.361 to 0.952 (mean value 0.776), expected heterozygosis varying from 0.302 to 0.795 (mean value 0.589), and polymorphic information content(PIC) ranging from 0.262 to 0.767 (mean value 0.526). The Cervus analysis indicated that there was combined non-exclusion probability (CEP) of 99.09% if parents were both unknown. The parentage allocation rate was 95.83% (12 parents) in 72 offsprings of the two families, with above 95% of both CEP and parentage allocation rate, which is a basic requirement value for parentage analysis. The finding shows that these six microsatellite markers are useful for parentage identification, and provides technical support for evaluating stock enhancement in Hemibarbus labeo in the future.

Key words： Hemibarbus labeo; microsatellite markers; parentage analysis; combined non-exclusion probability; assessment of hatchery contributions

中图分类号：Q959.468；Q348；Q16

文献标志码：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2018-258

文章编号：2095-1388(2019)05-0643-06

收稿日期： 2018-11-25

基金项目： 国家重点研发计划项目(2016YFC0502206)；四川省大渡河安谷水电站鱼类保护专题研究项目

作者简介： 阙延福和胥贤为本文的共同第一作者

阙延福(1978—)， 男， 副研究员。E-mail：[email protected]

胥贤(1990—)， 男， 工程师。E-mail：[email protected]

通信作者： 朱滨(1976—)， 男， 研究员。E-mail：[email protected]