2.按表36-1的组合将供体菌与受体菌按1∶1进行混合于无菌试管中,置37℃轻摇30min。

3.将4组混合物分别稀释至10-5;各取10-4、10-5稀释液0.1ml分别涂布在含链霉素和色氨酸平板上,同时取供体菌和受体菌液0.1ml分别涂在以乳糖作为惟一碳源的基本培养基(含VB1)平板上作为对照,置37℃培养2d。

4.观察平板上长出的菌落并计数。从4种互补实验平板上各随机挑选几个菌落分别在EMB乳糖平板上画线分离,将平板置于37℃培养2d。

5.观察EMB乳糖平板上长出的菌落是否有分离现象。

6.将4种实验菌株及EMB乳糖培养基上长出的互补菌落(共12株)分别接种在含乳糖的5mlLB液体中,置37℃振荡培养过夜

7.过夜培养物经4000×g室温离心10min,去上清液;用基本缓冲液洗涤菌体后制成悬浮菌液,调节细胞密度至OD600≈0.3。取1ml菌液,加1滴甲苯,立即振荡10s,打开试管置37℃摇动40min以除去甲苯,然后在37℃水浴中按以下程序进行β-半乳糖苷酶的定量测定。

取1ml经上述处理的菌悬液,加入0.2ml β-ONPG(O-nitrophenylβ Dgalactoside邻硝基苯,β D-半乳糖苷贮藏浓度为4mg/ml,溶液应为无色)轻轻摇动5min后再加入0.5mlNa2CO3(1mol/L)中止反应。取出反应混合物用分光光度计测定OD420值,比较各菌株的测定值。