其中两张片子的压法如下描述: 先剪一张比膜长 2~3 厘米的片子（以供贴胶带），然后剪 2 片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。

这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。

在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则在胶带的地方会影响显影。荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。

*注 1 其具体问题有二：一是背景较高, 二是没有条带. 形成机制为条带处 HRP 很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色, 周围因背景 HRP 较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。

如果没有背景则就是原因 3 的现象。在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间鼿 RP 稍减后重加底物迅速压片。

还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因 3 的现象。其分析和解决同上。

*注 2 其原因主要是 HRP 太高超速催化底物生成的产物使膜发黄, 压出的片子可以是正常的或和原因 1 或原因 3 的现象同时存在，只是一种现象，在压过的膜可以看出来（只在加底物后一段时间出现，几小时后可能还会消退，有时甚至刚加底物 1~2 min 就可以看出来，所以要把握时机）。

如果没有达到原因 1 和原因 3 的程度，那么这种情况一定能够看到很强的荧光，是一种良好的状态, 是我们所期盼的。如果压出正常片子而不出现原因 1 和原因 3 的现象, 可以不予处理。

但因为荧光太强极易导致条带增粗变大，所以也可以不稀释抗体而通过调整压片时间来解决，一般压 10s~30s，甚至可以 3~5s，即时根据结果在暗室调整, 荧光持续时间长的话都可连续压十数张片子而效果良好。

但也有这种情况，就是由于 HRP 过强无论怎么减少压片时间条带都依然粗大（如果时间过短如100kd）蛋白而言，一般不会出现过转情况，转膜不充分是主要原因，增加转膜力度无非是加大电压/电流，延长时间。

但对于小分子蛋白（