​​图 2. CUT&Tag 实验方案示意图。细胞核附着在磁性伴刀豆球蛋白 A 磁珠上，以便进行细胞处理并在每次洗涤后安全除去液体。对细胞核进行通透处理，同时与靶向目标蛋白的一抗一起孵育，然后与识别一抗的二抗一起孵育。蛋白 A-Tn5 融合蛋白与目标蛋白上形成的抗体复合物结合。添加 Mg2+ 离子时，Tn5 会切割所形成的复合物两侧的 DNA，并释放从细胞核中扩散出的已切割 DNA 片段。提取 DNA 并在基于 PCR 扩增制备 DNA 文库时使用。NGS 通过特定区域中序列的频率给出目标蛋白的结合信息。

该实验方案可分为五个部分：

CUT&Tag 通常使用未固定的新鲜样本作为起始材料，但对实验方案进行修改后，也可以使用冷冻样本，近期，还可使用提取细胞核后经福尔马林轻微固定的样本。固定步骤可以降低执行实验方案期间细胞核聚集在一起的可能性。使用由含 Triton X-100 的缓冲液产生的固定和冷冻保存样本时，可从所有缓冲液中除去洋地黄皂苷，这样可以进一步减少磁珠结块。但是，需要注意，在某些情况下，表位固定会干扰抗体的结合。

通常建议先使用不超过 500,000 个细胞（哺乳动物）。使用新鲜或冷冻组织时，细胞核的制备与 CUT&RUN 实验方案中的细胞核制备类似（Janssens et al ., 2018; Skene et al ., 2018）。

对于 CUT&RUN，细胞核与伴刀豆球蛋白 A 磁珠结合，可以使用磁力架轻松洗涤样本。但是，该步骤可以省略，并且整个实验方案可以按以下方式执行：每次洗涤后，温和离心，然后小心除去上清液，不干扰沉淀的细胞核。

对结合至伴刀豆球蛋白 A 磁珠的细胞核进行通透处理，同时在含洋地黄皂苷的缓冲液中与靶向目的蛋白的抗体（一抗）一起孵育。该步骤的持续时间可以调整，最短 2 小时，最长 5 天。抗体的推荐稀释度通常在 1:50 至 1:100（或 0.5 µg - 1.0 µg）之间，但需优化抗体的使用量。建议加入阳性（α-H3K27me3）和阴性对照（同型对照 IgG）样本。

一抗孵育后，用含洋地黄皂苷的洗涤缓冲液快速洗涤，然后将细胞核与二抗一起孵育，这里使用的二抗需靶向一抗，充当桥接抗体并且可以增加蛋白 A 结合位点的数量。在 CUT&RUN 实验方案中，这一步骤可以省略；但在 CUT&Tag 实验方案中，必须执行这一步骤，以增强信号。需要注意的是，抗体类别不同，蛋白 A 的结合效率也不同，因此需要事先检查二抗与蛋白 A 的兼容性。

为了将蛋白 A-Tn5 转座酶与目标抗体结合，需在含洋地黄皂苷的高盐缓冲液中稀释带接头的 Tn5 融合蛋白，并与细胞核一起孵育。在该步骤中增加盐浓度有助于减少脱靶标签化，主要是可接触的基因组区域的脱靶标签化，从而产生类似 ATAC 的峰。

与 Tn5 融合蛋白一起孵育后，洗涤细胞核，以除去未结合的 Tn5，并在添加 Mg2+ 离子的高盐洋地黄皂苷缓冲液中于 37℃ 下孵育，从而激活标签化。

添加 EDTA 终止标签化，并用 SDS 和蛋白酶 K 裂解细胞核。然后可以通过多种方式清除 DNA 片段，原实验方案建议先用苯酚/氯仿/异戊醇提取这些片段，再用乙醇进行沉淀。您也可以使用 AMPure 磁珠来清除 DNA 片段。建议在沉淀步骤中避免使用任何载体，例如糖原，因为载体会降低后续 PCR 反应的效率。

由于 Tn5 在标签化过程中会在 DNA 片段中引入兼容序列，所以使用通用 i5 引物和带条形码的 i7 引物进行的简单 PCR 反应就可以生成测序文库，让 DNA 文库的制备变得极为快速简便。该步骤与 ATAC-seq 类似，因此可以使用 ATAC 实验方案描述的引物序列（Buenrostro et al ., 2013）。但需要根据用户的机器调整循环程序。为了确保 PCR 有效，需要进行短时间的退火操作；如使用缓慢升温循环仪，则可以省略退火步骤，因为变性和延伸之间的冷却时间较长，足以退火。如使用快速升温机器，则必须增加退火步骤。通常，建议不超过 12 到 14 个扩增循环，否则，文库的复杂性将降低，而 PCR 的重复率升高。

在 PCR 扩增后，可用毛细管凝胶电泳法（例如 Bioanalyzer 或 TapeStation）对 CUT&Tag 文库进行评估。CUT&Tag 实验的失败通常表现在阳性对照样本中不存在核小体片段。

但是，如果只在转录因子 CUT&Tag 文库中观察到非常弱的信号，实验仍然可以继续，这种情况很常见。通过凝胶电泳进行评估后，可以使用 SPRI 磁珠清理并浓缩文库。可以将多个文库合并，每个文库获得约 200 万配对末端测序读段。

大部分常规 ChIP-seq 数据分析工具都可以分析 CUT&Tag 数据。Henikoff 实验室也专门为 CUT&RUN 和 CUT&Tag 数据设计了一些分析工具，例如 SEACR peak caller（Meers et al ., 2019b）。要想校准 CUT&Tag 数据，可以将重组蛋白 A-Tn5 残留的大肠杆菌 DNA 用作普通添加物。

由于 CUT&RUN 和 CUT&Tag 都可以使用未固定的新鲜样本，所以，它们的样本制备非常简单。但是需要以适合所用细胞类型的方式制备单细胞悬液，包括使用解离试剂（如 Accutase™）、从细胞培养皿上刮下细胞或机械解离组织等。

为了便于收集，可以在 10% DMSO 中冷冻保存样本，并在 Mr. Frosty 异丙醇冻存盒内冻存。两种方法均不需要固定样本，但是，如果磁珠在洗涤过程中结块，则应在孵育抗体前，于室温下使用 0.1% 福尔马林对样本进行轻固定，2 分钟即可。

至于 ChIP，并非所有抗体都可以用于 CUT&RUN 和 CUT&Tag。由于这两种方法较新，大多数抗体均未经过兼容性测试，因此终端用户需要对抗体进行测试和优化。ChIP 级抗体大都适用于 CUT&RUN 和 CUT&Tag，特别是适用于天然 ChIP 的 ChIP 级抗体。

试用非 ChIP 级抗体时，假设特异性已进行充分表征，可以首先选择能够识别目标蛋白天然形式的抗体；例如，在免疫沉淀或免疫细胞化学中起作用的抗体。同理，在考虑 CUT&RUN 或 CUT&Tag 实验所用的抗体浓度时，可以将免疫荧光法的推荐浓度作为起始浓度。需测试抗体与蛋白 A 和蛋白 G 的兼容性，必要时，可使用合适的二抗。

与其他实验类型一样，添加合适的对照是确保实验符合预期并能在实验失败时轻松确定问题区域的关键。

与 ChIP 不同，该实验方案不需要 input 样本，因为非抗体引导的 MNase 处理或标签化仅可识别可接触的染色质。为了从样本中获取背景并为实验设置基线，应添加 IgG 对照。在抗体对照方面，Henikoff 实验室建议使用 H3K27me3 作为 CUT&RUN 和 CUT&Tag 实验的阳性对照。使用未修饰的总组蛋白对照，例如总组蛋白 H3，可以按比例显示组蛋白修饰。

初版实验方案要求对洗涤缓冲液中所用的洋地黄皂苷的浓度进行测定，以确保有效地对细胞核作通透处理。如果您对实验方案作了改进，具体来说就是在洗涤缓冲液中添加了 NP40，则有可能不需要进行上述测定。但是，在新材料上使用这两种技术时，应牢记细胞核的通透效率。

采用滴定法测定每次反应使用的抗体量很重要，起始稀释度可以参考 ChIP 或免疫荧光检测法的推荐稀释度。

室温下，一抗孵育 1 小时即可；但在冷藏室中，孵育时间可延长至 1 至 5 天。对于每项实验使用的抗体，可以对孵育时间进行优化；但应牢记，孵育时间过长可能会增加背景信号，最终导致总体信噪比不佳。

如果在只使用一抗的情况下，回收率较低，则强烈建议在 CUT&Tag 中使用二抗，还可以考虑在 CUT&RUN 中使用二抗。添加二抗的另一个原因是为了避免蛋白 A/G 与一抗的配对不符合预期，添加合适类别的二抗可以改善这一点。

MNase 消化和 Tn5 标签化的时间可以根据目标蛋白进行调整。低丰度蛋白要想回收所有位点可能需要花费更多时间。要记住的是，消化或标签化时间过长可能会导致无针对性的切割，从而产生高背景信号。

模式生物的基因组小于人/小鼠基因组时，是否需要增加细胞数量？建议每个样本不超过 500,000 个细胞。一般来说，起始量为 50,000 个细胞比较好。与 ChIP 不同，CUT &RUN 和 CUT＆Tag 非常敏感，所以不需要上百万个细胞作为起始材料。细胞数量过多会降低收率，甚至降低文库的复杂性。

每次实验使用的细胞数不应超过 500,000 个。由于实验方案已对使用 50,000 至 500,000 个细胞时的磁珠数量进行了优化，因此不需要在实验方案建议的磁珠用量基础上另行增加。

建议在合适的缓冲液或培养基中添加 10％ DMSO，然后使用 Mr. Frosty 异丙醇冻存盒缓慢冻存。不建议快速冻存。

可以，但具体要看 ChIP 样本的固定和冷冻保存条件。由于 ChIP 样本的细胞数可能会超过 CUT&RUN 和 CUT&Tag 的推荐用量，并且使用强固定条件（如双重固定和淬灭）会损害 MNase 或 Tn5 的活性，所以标准实验方案可能不太适合。您可以将样本分成多份，这样可以轻松避免 ChIP 样本中细胞数超过 CUT&RUN 或 CUT&Tag 推荐起始量的问题。但是，样本固定和冻存等问题仍然存在。ChIP 实验方案的固定条件比较严格，很难与 CUT&RUN 或 CUT&Tag 兼容，因为严格的固定条件很可能会损害 MNase 或 Tn5 片段化/标签化目标序列的能力，并且已有大量报道暗示了这种不兼容性。另外，固定还有可能导致抗原表位被掩盖。因此，不建议固定样本。冷冻保存用于 CUT&RUN 或 CUT&Tag 的细胞时，需要使用 10% DMSO 和 Mr. Frosty 异丙醇冻存盒缓慢冻存样本。不建议在大多数 ChIP 实验方案中增加快速冻存步骤。

结块可能是因为细胞与磁珠的比例过高或含洋地黄皂苷的缓冲液中的细胞核/细胞发生裂解，从而释放 DNA 并导致结块。这种情况下，首先要检查细胞数量是否超过推荐数量。此外，在与抗体一起孵育前，建议先用福尔马林轻微固定样本（室温下使用 0.1% 福尔马林固定 2 分钟），以减少磁珠在含洋地黄皂苷的洗涤缓冲液中的结块。但需记住的是，固定可能会影响表位的可用性，因此需要对每种抗体进行测试。

建议在通透和抗体孵育缓冲液中添加 EDTA，因为它会螯合 Mg2+ 离子，从而终止所有依赖 ATP 的细胞过程（包括复制和染色质重塑），同时终止内源性 DNase。

这两种融合蛋白最初都由 Henikoff 实验室提供。现在已经有了制备融合蛋白的实验方案（Kaya-Okur et al ., 2019; Meers et al ., 2019a），而且质粒、蛋白 A-MNase、蛋白 A/G-MNase 和蛋白 A-Tn5 都可以从试剂供应商处购买。

按照标准实验方案的建议增加标签化缓冲液中的盐浓度即可解决这一问题。在某些情况下，依据目标蛋白的情况，可能会人为发现一些峰看起来像 Kaya-Okur et al 2019 的报道中所示的 ATAC 峰。

Brahma, S ., Henikoff, S. RSC-associated subnucleosomes define MNase-sensitive promoters in yeast . Mol Cell 73, 238–249, e233 (2019).

Buenrostro, J .D ., Giresi, P .G ., Zaba, L .C ., Chang, H .Y ., Greenleaf, W .J . Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods 10, 1213–1218 (2013).

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Janssens, D .H ., et al. Automated in situ chromatin profiling efficiently resolves cell types and gene regulatory programs. Epigenet Chromatin 11, 74 (2018).

Kaya-Okur, H .S ., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun 10, 1930 (2019).

Meers, M .P ., Bryson, T .D ., Henikoff, J .G ., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife 8: e46314 (2019).

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Thakur, J ., Henikoff, S. Unexpected conformational variations of the human centromeric chromatin complex. Genes Dev 32, 20–25 (2018).

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