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作者：

孔莹莹

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摘要：

乳铁蛋白是一种具有抗菌、抗病毒、免疫调节等多功能性铁结合糖蛋白,它广泛存在于哺乳动物乳汁中,一些外分泌物如泪液、滑液、唾液等也含有少量乳铁蛋白。近年来发现乳铁蛋白对骨生长和代谢的作用逐渐成为研究热点。本研究从新鲜牛乳中分离纯化得到乳铁蛋白,研究乳铁蛋白对成骨细胞增殖作用影响,考察乳铁蛋白对成骨细胞MAPK信号转导通路影响,同时研究不同加热处理参数对乳铁蛋白成骨活性影响及对成骨细胞MAPK信号转导通路影响,进而为乳铁蛋白在工业化生产中的应用工艺开发奠定一定的理论基础。本研究以新鲜牛乳为原料,通过脱脂、除酪蛋白、SP Sepharose Big Bead离子交换层析、Superdex200凝胶层析、超滤除盐浓缩及真空冷冻干燥等一系列过程,最终获得乳铁蛋白纯品。在纯化过程中对Superdex200层析条件进行优化,通过优化条件来分离纯化乳铁蛋白,得到乳铁蛋白分子量约为76kDa,乳铁蛋白纯度约为93.82%,得率为68.19%。通过差示扫描量热法测定得到的乳铁蛋白热变性温度为70.4℃和88.2℃。综合考虑乳铁蛋白热变性温度及实际生产加工中乳的热处理参数,设置以下加热参数:62-65℃加热处理30min、72℃加热处理10s、85℃加热处理10min、95℃加热处理10min对乳铁蛋白进行热处理,进而考察热处理对乳铁蛋白活性的影响。从新生SD乳鼠中提取成骨细胞,通过形态观察、HE染色、碱性磷酸酶染色及矿化结节染色来鉴定成骨细胞。运用MTT法进行细胞增殖实验,比较不同加热处理乳铁蛋白对成骨细胞增殖影响。研究结果表明未加热乳铁蛋白能显著促进成骨细胞增殖,且在生理浓度(1-100μg/mL)范围内呈剂量依赖关系。与未加热乳铁蛋白对成骨细胞增殖作用相比,62-65℃加热处理低浓度乳铁蛋白(1、10、50μg/mL)对成骨细增殖作用无显著变化,而处理高浓度乳铁蛋白(1000、1250、1500μg/mL)则会显著降低对成骨细胞增殖作用;72℃加热处理乳铁蛋白对成骨细胞作用,作用24h时,低浓度(1、10μg/mL)对成骨细胞增殖作用显著提高,作用48、72h时则无显著变化,72℃加热处理高浓度乳铁蛋白(1000、1250、1500μg/mL),作用24h、48h会显著降低对成骨细胞增殖作用,作用72h则无显著作用;85℃加热处理和95℃加热处理浓度高于50μg/mL乳铁蛋白都会显著降低对成骨细胞增殖作用。研究乳铁蛋白对成骨细胞MAPK信号通路影响发现:乳铁蛋白可通过介导ERK1/2、p38MAPK、JNK亚通路来促进成骨细胞增殖,通过介导ERK1/2提高ALP活性。不同加热处理乳铁蛋白则通过介导ERK1/2、p38MAPK、JNK亚通路抑制成骨细胞增殖和ALP活性。

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关键词：

牛乳 乳铁蛋白 成骨活性 信号转导通路 热处理 bovine milk lactoferrin osteogenic activity signaling pathway heattreatment

被引量：

1