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作者：

张璇

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摘要：

以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)作为辅因子的(R)-1-苯乙醇脱氢酶((R)-PEDH)专一催化(R)-1-苯乙醇生成苯乙酮,可以用来拆分外消旋1-苯乙醇获得手性(S)-1-苯乙醇。本研究旨在获得纯化的(R)-PEDH,并对(R)-PEDH的酶学性质进行研究;通过酶催化与光催化偶联法实现(R)-PEDH辅因子NAD+的再生;用有机金属框架ZIF-8将(R)-PEDH进行固定化,可有效地提高酶活稳定性与重复利用性。从土壤中筛选得到一株产(R)-PEDH的细菌,通过16S rDNA序列分析,初步鉴定该菌株为Lysinibacillus sp.。将液体培养获得的菌体通过超声破碎、硫酸按盐析、制备电泳提取分离后得到纯化倍数为60倍,比活为4.44 U/mg的(R)-PEDH。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示纯化后的(R)-PEDH为单一条带,分子量为28kDa。实验对(R)-PEDH的酶学性质进行了研究,(R)-PEDH在催化氧化反应时最适pH和温度分别是9.5与70℃,在催化还原反应时最适pH和温度分别是6.5与65℃。在最适条件下,(R)-PEDH对(R)-1-苯乙醇的Km为0.78mM,kcat为 123 s-1,(R)-PEDH 对苯乙酮的 Km为0.56mM,kcat为125 s-1。采用(R)-PEDH催化氧化反应与光催化偶联来进行NAD+的再生,以VB2作为光敏剂,LED灯作为光源,偶联反应在pH 8.0,37℃下进行。48h后2.7 mM(R)-1-苯乙醇被完全转化成苯乙酮,且反应体系只有0.17 mMNAD+。整个反应系统不需要添加额外的底物作为电子受体,仅生成水无其他副产物。利用有机金属框架ZIF-8结构形式对(R)-PEDH进行了固定化,形成的ZIF-8@(R)-PEDH平均粒径在500 nm左右,颗粒大小分部均匀。实验探究了 20%甘油对ZIF-8的形成无影响,NaCl会影响ZIF-8的形态结构及面貌,从而影响ZIF-8@(R)-PEDH的酶活包裹率。ZIF-8@(R)-PEDH的酶活包裹率为44%,理论蛋白包裹率为76%,对(R)-1-苯乙醇的Km值0.046 mM,固定化酶催化氧化反应时的最适pH和温度分别为9.5和65℃。ZIF-8@(R)-PEDH的酶学性质与游离酶相比,与底物的亲和力更强,能抵抗胰蛋白酶的分解,而且可以回收利用。

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关键词：

乙醇脱氢 酶的分离纯化

学位级别：

硕士