目的 ： 采用碱变性法，学习小规模制备质粒DNA的技术

原理 ： 碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

仪器与主要试剂

仪器（见附录）：

主要试剂： 溶液I： 50 mmol/L 葡萄糖

10 mmol/L EDTA

25 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）

2毫克/毫升 溶菌酶

溶液II： 200 mmol/L NaOH

1% SDS

溶液III： 3 mol/L NaAc （pH4.8）溶液

TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ，pH 7.5

1 mmol/L EDTA

实验方法：

1.将大肠杆菌菌落挑取一环接种在含有2毫升加入抗菌素的LB液体培养基的10毫升试管里，37℃振培过夜，16~18小时

2.转移以上菌液1.5毫升于EP管中，8000rpm离心30秒

3.小心去除上清，并用吸水纸吸干残余液体，再将沉淀物在振荡器上振匀

4.加入溶液I 100μl，盖紧EP管盖，翻转数次，冰上放置10分钟

5.加入溶液II 200μl，温和翻转EP管5次（可观察到溶液逐步由混浊变为透明），冰上放置5分钟

6.加入溶液III 150μl，将EP管盖紧后累累来回翻转23次，混匀后冰上放置20分钟

7.12000rpm离心15分钟

8.将上清转移到另一个EP管中（吸取时不可吸入底部的沉淀）。加入等体积的酚和氯仿：异戊醇各抽提一次

9.加入1毫升预冷的无水乙醇和1/10体积的NaAc（3 mol/L，pH5.2），盖紧，并翻转EP管数次混匀

10.置于-20℃冰箱1~2小时

11.15000rpm离心15分钟，去除上清，收集管底白色沉淀

12.70%乙醇洗涤一次，空气干燥或真空抽干

13.将沉淀溶于50μl TE缓冲液或去离子水，完全溶解后，-20℃保存

14.取样5μl，在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳，观察DNA条带。

附注：

1.溶液Ⅰ---溶菌液

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1，4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中PH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械切力作用降解。

EDTA的作用：

（1）螯合Mg2+ 、Ca2+ 等金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时一定的金属离子作辅基）。

（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

2.溶液Ⅱ--NaOH-SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH>12或pH