透析袋原理是什么?根据分子量筛选,使用方法的详细介绍 |
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一、透析的原理 透析只需要使用专用的半透膜即可完成。通常是将半透膜制成袋状,将生物大分子样品溶液置入袋内,将此透析袋浸入水或缓冲液中,样品溶液中大分子量的生物分子被截留在袋内,而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外,直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为「保留液」,袋(膜)外的溶液称为「渗出液」或「透析液」。 透析的动力是扩散压,扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度,正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度,还正比于膜的面积和温度,通常是 4℃ 透析,升高温度可加快透析速度。 二、透析的过程 1)把适量的透析液(缓冲液)加入透析装置。透析液的体积应为样品体积量的 100 倍。(例如,在 1L 透析液中透析 10 ml 的样品) 2)裁剪适当长度的透析管。预留一段额外长度(约占总样品体积量的 20%)作为头部空间。 3)把透析管插入打开的透析夹,在约超出透析夹 3-5 mm 的位置再夹住。不要折叠透析袋。 4)由透析管开口端将样品装入。调整一下顶部空间的长度,夹紧透析夹。 5)把透析样品放在合适的透析缓冲液中。 6)透析要根据具体的应用需求。通常情况下,允许过夜透析。在持续透析的过程中,至少要进行 3 次全部更换透析液。建议在(透析后)2-4 小时,6-8 小时和 10-14 小时(第二天早晨)更换透析液。在最后一次透析液的更换后,要至少继续进行 2 小时的透析。 注意:对于高浓度污染物,样品可能需要较长的时间透析,透析液需要更频繁的更换。 7)透析温度主要取决于样品。温度最高限制主要取决于膜的类型。纤维素透析袋可以承受的温度高达 37℃。再生纤维素透析袋可以承受的温度高达 60℃。 三、透析袋的材质与规格 透析膜可用动物膜和玻璃纸等,但用的最多的还是用纤维素(再生纤维素 RC、纤维素酯 CE、PVDF 等)制成的透析膜,目前常用的是美国光谱医学公司(spectrum)和美国联合碳化物公司(union carbide)生产的各种尺寸的透析管。截留分子量 MwCO(即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量,缩写为 MwCO)大概有 100、500、1000、2000、3500、8000、10000、15000、20000、25000、50000、100000、250000、500000、1000000 等种类,单位为道尔顿(D)。截留分子量越大也就是说透过性越大,一般而言,透析袋截留分子量越小价格越贵,因为截留的分子越小要求透析袋越密,价格越贵。商品透析袋制成管状,其扁平宽度为 8 mm-77 mm 不等。 半透膜制成的透析袋作为工具,存在透析时间长、样品回收率不高、无法处理微量样品的难题。目前已有专为 10 到 100ul 的微量样品透析而设计的透析工具。把样品加在平底的透析管(类似小量提质粒的离心纯化柱,可以插入 1.5 ml 的离心管中,管底是半透膜)中,再插入特制的浮板(浮漂)中,置于缓冲液面 10 min 即完成透析。实验表明,100ul pH2.8 的 IgG 洗脱液在 1L pH9.4 的缓冲液中只需不到 10 min 即可平衡到 pH9.4。如果在装缓冲液的烧杯底加磁力棒搅拌则更能加速透析速度。这种方法有较高的回收率,能够节约珍贵的样品,并能节约时间,特别适合摸条件的预实验。 透析袋的标识: 1)27 mm(MD34)透析袋(MW:3500) 27 mm 是指透析袋干燥时的直径。 MD34 mm 是指透析袋干燥时压平的宽度。 MW:3500 是指透析袋的截留分子量。 2)选择适合的透析膜材质 每种膜对不同的分子具有不同的亲和性。对于球蛋白,相对的结合亲和性由低到高为 CE<RC<PVDF。 透析袋使用前的处理: 方法一: 把透析袋剪成适当长度(10-20 cm)的小段。 在大体积(500 ml)的 2%(w/v)的碳酸氢钠和 1 mmol/L EDTA2Na(pH = 8.0)中将透析袋煮沸 10 min。 用蒸馏水彻底清洗透析袋。 放在 500 ml 的 1 mmol/L EDTA2Na(pH = 8.0)中将之煮沸 10 min。 冷却后,置于 30% 或者 50% 的酒精中,放于 4℃ 冰箱,必须确保透析袋始终浸没在溶液内。从此时其取用透析袋必须戴手套。 在使用前要用蒸馏水将透析袋里外加以清洗干净。 方法二: 可先用 50% 乙醇煮沸 1 h,再依次用 50% 乙醇、0.01mol/L 碳酸氢钠和 1 mmol/L EDTA(pH = 8.0)溶液洗涤,最后用蒸馏水冲洗即可使用。 方法三: 实验要求不高的可以用简易方法处理。用沸水煮 5 至 10 min,再用蒸馏水洗净,即可使用。 不过现在也有杂质含量极少,无需预处理,只需用去离子水清洗即可使用的即用型透析袋。这种透析袋具有特殊的生物技术膜,不含硫化物及金属杂质。只是比普通型透析袋稍贵。 3) 透析袋浓缩样品 大多数情况下,透析袋纯化的样品会被稀释。如果下游需要的样品浓度比较高时,可能需要对样品进行浓缩。透析袋本身浓缩的方法如下。 (1)吹干浓缩法: 将蛋白溶液装入透析袋内,放在电风扇下吹。此法简单,但速度慢,且温度不能过高,最好不要超过 15℃。 (2)透析袋浓缩法: 利用透析袋浓缩蛋白质溶液是应用最广的一种。将要浓缩的蛋白溶液放入透析袋(无透析袋可用玻璃纸代替),结扎,把高分子(6000-12000)聚合物如聚乙二醇(碳蜡)、聚乙/烯吡/咯、烷酮等或蔗糖撒在透析袋外即可。也可将吸水剂配成 30%-40% 浓度的溶液,将装有蛋白液的透析袋放入即可。吸水剂用过后,可放入温箱中烘干或自然干燥后,仍可再用。 主要用于更换蛋白质的缓冲液,得有透析袋。不需要特殊的仪器。一般用得是 PEG20000 进行实验,简单,快速,对蛋白没什么影响。 此外,还有其他的样品浓缩方法,如冷冻干燥浓缩法、超滤膜浓缩法等。
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