前言

近年来腺相关病毒(AAV)载体逐渐发展为基因治疗领域的热门递送平台，相关研究在AAV载体衣壳的优化、病毒基因组的设计等方面取得了巨大进展，大大促进了基因治疗领域的发展，尤其是最近两款基于AAV的基因疗法获批之后，引起了人们对AAV病毒载体的极大关注。  

1

AAV载体发展史

AAV载体发展时间线

腺相关病毒(AAV)最早于1965年首次在实验室的腺病毒制剂中被发现，在对AAV进行研究的前15-20年的时间里，科学家们主要将研究方向集中在AAV的基因结构与组成、DNA的复制与转录、感染的潜伏性以及病毒粒子的组装等方面，并于1982年成功完成了AAV2基因组的克隆以及测序工作。在经历了长达20多年的基础理论研究之后，AAV的神秘面纱逐渐被揭开，这些早期研究为AAV作为基因递送载体而被广泛使用提供了坚实的理论基础。

AAV载体于1995年首次用于治疗人类的囊性纤维化病，步入21世纪后越来越多的AAV血清型家族被发现，这极大的丰富了体内基因递送的AAV载体工具箱。2008年基于AAV载体的基因疗法在治疗莱伯氏先天性黑蒙症的疗效方面取得了令人信服的证据。2012年首个基于AAV的基因治疗药物Glybera(用于治疗脂蛋白脂酶缺乏症LPLD)获得了欧洲药品管理局EMA的批准，5年后Luxturna成为首个获得美国食品药品管理局FDA批准的用于治疗由RPE65基因突变导致的遗传性视网膜疾病的AAV基因治疗产品。

尽管基于AAV载体的基因治疗产品在临床上取得了令人鼓舞的结果，但必须要承认的是这种新型的体内基因递送平台同样存在很大的局限性与挑战性，例如从科学角度来看AAV载体在体内与免疫系统的相互作用往往导致疗效大打折扣，再比如说从生产角度来看AAV载体的生产规模、制造成本以及产品定价往往很难平衡，这些问题将直接导致产品最终上市后的受益人群的范围以及市场规模等。基于这些面临的问题与挑战，越来越多的AAV生物学研究以及临床转化试验正在如火如荼的进行当中。

2

野生型AAV构造

AAV衣壳晶体结构

AAV属于细小病毒科依赖性细小病毒属，它由一个直径约26nm的二十面体蛋白质衣壳和一个约4.7 kb的单链DNA基因组组成，该基因组可以是正义链也可以是反义链。病毒衣壳由VP1、VP2和VP3三种亚基构成，三种亚基的比例为1：1：10，共60份拷贝。目前的普遍共识是AAV病毒不会引起人类疾病，安全性非常高。

基因组两侧有两个T型末端反向重复序列(ITRs)，它们主要担任病毒复制起点和包装信号的角色。基因组主要由rep基因和cap基因构成，其中rep基因负责编码病毒复制所需的四种蛋白质Rep78，Rep68，Rep52和Rep40(按分子量命名)，cap基因通过不同起始密码子的选择性剪接和翻译实现三种衣壳亚基的编码。除此之外，负责编码装配激活蛋白(AAP)的第三个基因被编码在cap编码序列的不同阅读框中，此蛋白已被证明可以促进病毒粒子的装配。

AAV基因组结构

在人类细胞中AAV基因组可以整合到一个被称为AAVS1的基因组位点从而实现长期潜伏，这一现象的部分原因是AAVS1位点的序列和ITR的序列有很大的相似性，位点的插入同样需要rep基因编码蛋白的活性，因为人们发现缺乏rep基因的重组AAV载体的基因组整合效率大大降低。

3

野生型AAV转变成

重组AAV载体的改造方式

重组型AAV载体的基因组拆分示意图

为了将野生型AAV变成适合体内基因递送的重组型AAV载体，研究人员对其进行了一系列的遗传改造。重组型AAV载体的病毒衣壳依然沿用野生型AAV的序列与构造，但是病毒衣壳内部的基因组被完全剔除了rep基因和cap基因，仅仅保留有了负责引导病毒载体基因组复制和包装的ITRs序列。rep基因和cap基因的位置被需要递送的基因以及表达调控元件所替代，与野生型AAV相比，这种改造在很大程度上提高了AAV载体的装载量并极大降低了体内免疫原性和毒性。

与AAV载体复制和装配相关的rep、cap基因元件以及腺病毒辅助基因元件被分别克隆到其它质粒载体上，这样的设计允许利用多质粒瞬转系统大量制备科研或者临床级别的重组AAV载体产品。

值得注意的是重组AAV载体基因组的最大装载量不超过5kb，这就要求研究人员必须仔细设计有效载荷，不仅要考虑治疗性转基因序列，还要考虑基因表达所需的调控元件(例如启动子和多聚腺苷化信号等)。

4

重组AAV载体转染途径

重组型AAV载体的转染示意图

重组AAV载体的有效性在很大程度上取决于病毒衣壳和靶细胞表面受体分子之间的相互作用以及病毒粒子内化后的后续下游事件的发生。现有的血清型被认为可以识别不同的细胞受体如糖蛋白等，因此AAV载体可以显示出不同的组织和细胞类型的趋向性，受体与共受体的组合识别模式也在重组AAV载体与细胞表面的结合和内化中发挥着重要作用。多种血清型的受体互作区域已经被确定，这为具有期望属性衣壳的合理性工程化改造提供了技术路线图。

AAV载体首先被宿主细胞表面的的糖基化受体识别，通过网格蛋白介导的内吞作用触发了病毒颗粒的内化，然后通过细胞骨架网络进行AAV载体的细胞质传输。由于胞内体中pH值较低，VP1/VP2区域的构象逐渐发生变化，在从胞内体逃逸之后，AAV颗粒通过核孔复合体进入细胞核并完成去衣壳过程，部分AAV颗粒也可能被蛋白酶体降解失活。

目前使用的重组AAV载体的基因组包括单链AAV(ssAAV)和自主互补AAV(scAAV)两种类型。ssAAV里面包装有正义链或反义链基因组中的一种，这些单链形式的基因组在到达细胞核时仍然处于转录惰性的状态，转化为双链DNA是进行转录的先决条件。

双链DNA的形成可以通过宿主细胞DNA聚合酶进行第二链合成或通过可能共存于细胞核中的正负链进行退火来实现。因为scAAV在设计上已经是双链形式，因此它们可以立即进行转录。AAV基因组中存在的ITRs序列可以驱动分子间或分子内重组从而形成环状游离型基因组，这种形式的基因组可在细胞核内持续存在。

5

重组AAV载体的生产方式

目前比较流行的一种重组AAV载体制备方法是三种质粒瞬转进入组成型表达腺病毒E1a和E1b基因的HEK293细胞，其中一个质粒表达腺相关病毒的rep和cap基因；另一个质粒表达需要在体内递送的目标基因；还有一个质粒表达具有辅助功能的腺病毒基因，例如表达分别负责基因复制、mRNA加工和蛋白翻译的E2A、E4和VA基因。此外原来贴壁生长的HEK293细胞已经可以被驯化成悬浮生长细胞，这有助于生产规模的扩大和产量的提高。

稳定转染AAV的rep和cap基因以及带有ITRs的目标基因的HeLa细胞是一种适用于大规模生产的可行解决方案。在该平台上只需引入腺病毒即可开始生产，然而该平台存在两个缺陷，一是每一种病毒衣壳和转基因结构的组合都必须独立生成新的生产细胞系，二是腺病毒在生产流程中成为一种外源性病毒，幸运的是56℃加热0.5 ~ 1.0 h可使腺病毒失活，但对重组AAV载体的稳定性和传染性影响不大。

复制缺陷型单纯疱疹病毒(HSV)也可以作为大规模生产重组AAV载体的辅助平台并已成功用于临床。用HSV辅助制造的重组AAV1载体进行的首个临床试验于2010年启动，该基因治疗产品用于治疗α1-抗胰蛋白酶缺乏症。

无哺乳动物细胞的重组AAV载体生产平台也已经为了解决来自包装细胞基因组污染的问题而开发出来。一般是通过将杆状病毒表达载体BEVs转染到草地贪夜蛾Sf9昆虫细胞中进行载体的生产。Sf9细胞易于表达腺相关病毒的rep和cap基因，并且除了BEV以外不需要提供其它辅助病毒基因。然而利用第一代BEV-Sf9系统生产的部分血清型的AAV载体发生了病毒衣壳VP1表达的降低，这导致了更低的转导谱，但是通过病毒衣壳蛋白化学计量设计弥补了这一缺陷。重要的是BEV-Sf9系统生产出的AAV载体衣壳内的外源基因组明显减少，测序发现杆状病毒DNA占比低于2.1%，而Sf9宿主细胞DNA基本低于0.03，这一系统同时还具有降低病毒载体空壳率的优势。

6

AAV载体在基因治疗中

面临的挑战

免疫屏障 重组AAV载体可能会遇到在人群中广泛存在的中和抗体，这会极大地影响基因的传递效率。此外，重组AAV载体也会诱导衣壳特异性抗体的产生。重组AAV的衣壳和基因组可能通过TLR2和TLR9受体来触发先天性免疫。衣壳经过蛋白酶体降解而产生的肽由主要组织相容性复合体MHCI类分子提供给CD8+T细胞，CD8+T细胞可发挥破坏性的细胞毒性作用来消除AAV转导的细胞，导致转基因表达的丧失。转基因产物也可以引发体液免疫反应从而产生转基因产物特异性抗体，从而破坏治疗效果。

重组型AAV递送的免疫屏障

组织屏障 对于全身给药的病毒，肝脏通常是默认目的地，因此当预期目标是别的组织器官时，肝脏很有可能形成组织障碍。血脑屏障内的内皮细胞层也会构成进入脑部组织的物理屏障。此外，当进行全身给药或局部给药后，AAV载体也可能因为病灶区的组织过大而降低转染效率，也可能因为与脏器的基质细胞结合而无法深入组织病灶区行使功能。

细胞屏障 靶细胞表面可能缺乏与重组AAV载体结合和内化所必需的初级/次级受体。此外，胞内体逃逸、蛋白酶体逃逸、病毒的入核能力和载体脱衣壳能力都是形成有效转导的细胞水平障碍。

病毒包装屏障 野生型AAV具有4.7 kb的单链DNA基因组，基于重组AAV的基因传递载体已被证明能够在接近野生型滴度和转染效率的情况下包装高达5 kb的基因组，但是超过此水平包装效率显著下降，截短形式的基因组会被错误的包装进入病毒衣壳内从而影响转染滴度。

7

工程化改造策略助力临床转化

病毒衣壳的发现与改造策略

4种衣壳发现与改造策略示意图

●  通过衣壳重组或PCR错配等方法进行定向进化可以创建许多独特的衣壳组合，这些衣壳组合可能具有独特和有利的载体特性。

●  开发非人类来源的衣壳序列可能避免人类体内已经存在的多种血清型抗体的免疫封锁。

●  利用现有的衣壳生物学知识和宿主细胞靶点来合理设计衣壳，专门识别组织特异性或细胞特异性的细胞外标记物或逃避免疫监视。

●  利用计算机算法可以在不完全熟知AAV衣壳的生物学原理的前体下设计天然情况下不存在的衣壳结构。

重组AAV载体基因组的设计与改造

●  根据递送基因的特性选择合适的调控元件来调节基因表达强弱和特异性。

●  选择具有相同功能的截短形式基因来治疗因较长基因突变引起的疾病。

●  将较长基因分装到两个重组AAV载体中，转染到细胞之后通过同源重组的方式合并成完整基因从而突破5kb的装载量限制。

●  通过同源重组修复机制进行基因编辑提高递送基因体内的持久性。

8

临床前景

一项截止于2020年1月1日的回顾性分析对之前基于重组AAV载体的临床试验进行了详尽的归纳总结。研究人员从数据库中获取了149项非重复性的临床试验，其中94项显示试验已经完成，51项达到了疗效终点。

临床试验结果统计

从144项披露了病毒衣壳数据的临床试验中分析发现重组的AAV2血清型仍然处于主流位置，并且具有最多的安全性和有效性证据。从104项披露了启动子数据的临床试验中分析发现像CBA、CAG和CMV等泛表达类的启动子依然受到研究者的广泛青睐，有趣的是近年来超过25项临床试验使用了组织特异性启动子来实现特定组织的表达，例如白蛋白启动子和突触蛋白启动子等。

AAV血清型及启动子使用趋势

从可供分析的94项已完成的临床试验的分析中发现，大多数研究集中在眼睛、肝脏、肌肉和中枢神经系统这4类器官。自2015年以来使用AAV8和AAV9衣壳将药物输送到中枢神经系统(CNS)的试验数量有所增加，这反映出利用重组AAV载体的方式来治疗中枢神经系统疾病的趋势。

组织器官靶向分析及适应症统计

对101项具有安全数据的临床试验进行分析发现，3328例受试患者中有9例发生4-5级严重不良事件(SAEs)，并被认定为是治疗突发性严重不良事件(TESAEs)，没有患者的死亡直接归因于转基因或衣壳本身。分析发现静脉和鞘内给药比大多数其他给药方式更安全，颅内给药在SAE发生率方面与其他给药方式相同，但发生的SAE的严重程度和临床显著性趋势更高。在所有被分析的试验中，平均有35%的试验结果被认定为TESAE，值得注意的是肌内基因治疗导致的TESAE事件数目最低。

AAV基因治疗的安全性趋势

综上，基于超3000名患者的覆盖度以及20多年的时间跨度，回顾性临床分析表明基于重组AAV载体的基因治疗是一种安全和耐受性良好并且治疗效果积极的治疗方式。

总结

尽管针对AAV的研究是病毒学的一门学科，但将AAV转化为基因治疗载体需要更多学科的参与。如果没有分子生物学、生物信息学、流行病学、结构生物学、免疫学、基因组学和属于生物医学研究范畴的所有其他学科的贡献，就不可能取得这些进展。基因疗法代表着治疗人类疾病的终极前沿之一，人类基因组计划已经实现了对基因组的近乎完整的注释，此外探索表观基因组的GWAS项目和大数据研究为将遗传差异与疾病联系起来提供了蓝图。这些成就让我们进入了非常激动人心的基因组学和基因疗法时代，利用遗传密码开发创新药物亟需所有科学领域的参与，借此将基于重组AAV载体的基因疗法带到崭新的高度。

参考文献

1.Kotterman MA, Schaffer DV. Engineering adeno-associated viruses for clinical gene therapy. Nat Rev Genet. 2014 Jul;15(7):445-51. doi: 10.1038/nrg3742. Epub 2014 May 20. PMID: 24840552; PMCID: PMC4393649. 

2.Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019 May;18(5):358-378. doi: 10.1038/s41573-019-0012-9. PMID: 30710128; PMCID: PMC6927556. 

3.Kuzmin DA, Shutova MV, Johnston NR, Smith OP, Fedorin VV, Kukushkin YS, van der Loo JCM, Johnstone EC. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nat Rev Drug Discov. 2021 Mar;20(3):173-174. doi: 10.1038/d41573-021-00017-7. PMID: 33495615.

* 推文用于传递知识，如有版权等疑问，请于本文刊发30日内联系BiG生物创新社。