目前，全球感染性疾病的发病率有所上升，病原体呈现多样化和复杂化的发展趋势。重症急性呼吸综合征、新型冠状病毒感染、新变异型克雅病、H7N9 禽流感等新发感染性疾病不断出现。而 HIV、多重或广谱耐药的结核分枝杆菌、沙眼支原体等经典感染性疾病病原体又死灰复燃或出现新的致病特征。各种新发和再发的感染性疾病、不易发现的多重感染以及不明病因的发热等，都给人类健康带来了巨大的威胁，因此，临床上对感染性疾病诊断的准确性和时效性提出了更高的要求。

感染性疾病是临床常见疾病之一，多为细菌、病毒、真菌和寄生虫等病原体及其产物所引起的局部或全身性炎症或器官功能障碍，具有较大的危害性和较高的病死率。感染性疾病的致病因素复杂，临床表现多样。快速、全面、准确地鉴别病原体，是临床医生及时、有针对性地采取治疗措施的前提。

图1.传统病原体检测方法与高通量测序方法的比较图示

传统的病原微生物检测手段包括形态学检测、培养分离、生化检测和免疫学检测。这些方法受限于周期长、阳性率低（灵敏度不足&检测覆盖不足）和对操作人员的技术水平要求比较高等因素。荧光定量PCR技术和等温扩增技术等分子生物学的检测方法部分解决了上述问题，通过对核酸特异性序列的检测，可在2-4小时内快速判断病原体的种类，并能够准确实现分型、耐药基因检测。目前基于PCR的分子检测手段适用于常规的临床常见病原体的检测，而对于混合感染和由于罕见病原导致的感染性疾病，荧光定量PCR等检测手段则显得捉襟见肘。

随着基因组学技术的发展，高通量测序技术（也称下一代测序技术，NGS）已经能够做到不依赖于传统的微生物培养，可直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对，实现感染性疾病的溯源、检测、分型和耐药评估等多个方面，受到越来越多临床和科研工作者的关注。其中，基于NGS鉴别微生物的主要方法有两种，分别是宏基因组测序（metagenomic NGS，mNGS）和靶向测序（targeted NGS, tNGS）。

目前临床上使用的宏基因组测序主要指鸟枪法宏基因组(shotgun metagenomics)，是对人体样本或特定环境样品中的总核酸（DNA或RNA）进行高通量测序，通过比对数据库，得到感染病原体的相关信息(图2)。

图2. 宏基因组测序的临床应用。(A)在传染病诊断中的应用包括直接鉴定原始临床样本中的微生物（Aa）；通过鉴定耐药基因预测抗生素耐药性（Ab）；检测物种或菌株水平的毒力决定因素，如分泌特定的内毒素或外毒素（Ac）；抗病毒抗性预测（Ad）。

由于mNGS能够检测出新发和罕见病原体，它在重症感染领域，特别是疑难、罕见病导致的重症感染中发挥了难以替代的作用：2016年FDA认可NGS用于病原微生物的诊断和耐药毒力分析；2019年病原宏基因组被写入成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊疗指南；2019年中华急诊医学杂志发表《宏基因组诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》；2020年，中华危重病急救医学杂志发表《宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识（第一版）》。各项共识肯定了mNGS快速全谱的病原体鉴定为重症患者，尤其是重症监护病房（ICU）患者在争取靶向治疗的时间、减少其他常识性药物的使用方面的贡献。但是由于mNGS较高昂的成本和比较高的实验条件要求，目前尚未纳入常规临床检验中。

mNGS检测方法也面临不少挑战，检测结果的灵敏度受宿主及其他微生物背景核酸的影响，尤其对耐药基因（ARGs）的检测灵敏度显示出明显不足。在组织样本中，人源DNA的含量会在99%以上，这对样本的去除人源背景和测序通量提出来一定的要求。此外，污染与定植菌对结果判读的影响，数据库的完整性和准确性不足，临床阳性报告和阴性结果的判读等因素也需要我们不断思考和完善。目前大部分的研究和应用是以病原体的定性分析为主，须要进一步扩大数据库规模，将定性信息转变为定量信息，以确保临床诊断结果的准确性。

mNGS检测流程可分为样本处理、核酸提取、文库制备、模板制备和测序、数据分析以及报告出具几个步骤（图3）。开展过程中需要在实验的关键步骤设定质控点和合适的对照来尽量减少假阳性和假阴性检测结果的发生，这些都对开展mNGS检测服务的公司提出了很高的要求。随着mNGS在临床范围内的应用日渐增多，外送的方案由于时间周期较长、流程不可控，如何在院内建立标准流程和院内检测也成为我们思考的问题。

图3. 高通量测序实验流程

相比于mNGS，靶向测序(tNGS)通过是超多重PCR的方式检测样本中已知病原微生物和耐药基因信息，可以高灵敏及低测序成本的双重优化。tNGS检测目标仅包含预先设定的病原体，特异性扩增待检靶标基因，因此不会受到人源核酸和背景菌群的影响。通过特异性引物的设计，一次可扩增几百到几千个扩增子，能够实现病毒、细菌和耐药检测单管建库，无需RNA和DNA分别建库。这种方法相比于mNGS测序成本低，对丰度低的病毒、耐药基因和突变检测具有更高的灵敏性。tNGS数据分析流程更加简单，且整个流程更易实现自动化(图3)，可应用在常规临床病原体检测中。要注意的是，试剂盒设计阶段可以结合临床和检验科室对常见的病原种类、耐药基因进行筛选，定制得到适合医院的检测Panel，助力感染性疾病的精准治疗。

图4. 靶向测序建库流程和在临床病原检测中的应用

除了应用在判断感染病原和耐药检测方面，NGS在感染性疾病的新的关注点还在病原体与宿主的相互作用上，针对样本的RNA宏基因组测序在鉴定RNA病毒的同时，还能够获取到宿主转录组信息，进而对宿主的基因表达调控做出更进一步的研究。此外，病毒感染和疫苗注射后，人体免疫系统的反应状况也是目前感染性疾病的研究方向之一，通过对免疫组库（如TCR和BCR免疫组库）进行高通量测序，来进一步理解人体如何对抗病原体感染和评估疫苗的有效性。

高通量测序技术在临床病原体检测中的应用显示出巨大的潜力，相比于其在无创产前检测（NIPT）和肿瘤靶向用药伴随诊断方面的应用，临床病原高通量测序依旧面临着巨大的挑战，它的规范化和成熟化还有一段路要走。对于感染性疾病的检测，根据检测需求，兼顾时间、检测成本、可获得临床指导信息等多个角度灵活选择检测方案，以达到精准用药、患者获益最大化的目的。基于核酸的分子检测和测序方案是对传统检测方法的有效补充，但在很多方面还无法替代传统的药敏等基于表型的检测。临床对“快、准、稳”的需求也推动着设备和试剂提供商在多方面的创新。

作为检验科的医生，我们既要对传统方法了如指掌，也要拥抱新技术、了解新手段，让所有的检测方法成为我们手中的有力武器。运用我们积累的丰富检验经验，了解临床科室的需求，更好地帮助患者在临床上获益。我们也要充分认识到高通量测序距离真正应用于感染性疾病检测还有一些差距和不足。相信未来NGS技术将会逐步解决感染性病原体鉴定的难题，进一步推动临床微生物学和感染病学的发展。

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原标题：《公卫·科普 | 高通量测序技术——打开病原体诊断的“钥匙”》

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