中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会, 中国抗癌协会肿瘤基因诊断专业委员会, 中国研究型医院学会超微与分子病理学专业委员会, 等. 基于实时荧光定量PCR技术的肿瘤分子病理检测临床实践中国专家共识(2023版)[J]. 中华肿瘤杂志, 2023, 45(9):763-772.

DOI: 10.3760/cma.j.cn112152-20221231-00868.

 摘   要 

基于实时荧光定量PCR(qPCR)技术的肿瘤分子病理检测具有操作简便、报告周期短、灵敏度高、结果判读标准化等优点。然而，在临床实践中，qPCR技术的性能验证、质量管理、异常结果处理等问题相对复杂，缺乏统一规范和标准。因此，专家共识旨在从qPCR检测全流程角度，对影响检测结果的重要环节、检测过程中遇到的常见问题及异常结果判定及处理等提供规范化意见，达成基于qPCR技术的肿瘤分子病理检测临床实践中国专家共识，以规范检测流程并提高结果准确性，促进技术发展和更为广泛的临床应用。

【关键词】肿瘤; 实时荧光定量PCR; 分子检测; 分子病理; 专家共识

恶性肿瘤分子病理检测是个体化治疗的前提和基础。目前，我国常用的分子病理检测平台包括实时荧光定量PCR(quantitative real－time PCR, qPCR)、荧光原位杂交、Sanger测序和高通量测序等，其中qPCR技术具有操作简便、耗时短、灵敏度高等优势。qPCR技术利用不同波长的荧光基团标记探针，动态监测反应管中的荧光强度，形成PCR扩增曲线，间接反映靶基因扩增产物含量，从而对靶基因变异情况进行定性或半定量分析。目前，常见的qPCR技术包括扩增阻滞突变系统PCR、逆转录qPCR、多重连接依赖性探针扩增PCR技术和数字PCR技术等，能够对基因点突变、插入缺失、融合等进行检测。

qPCR技术近年来在肿瘤分子病理检测领域得到广泛应用，检测标准化和规范化对提升肿瘤分子病理检测水平和促进个体化诊治具有重要意义。本共识由具有丰富理论和检测实践经验的病理、分子病理专家共同发起并制定，旨在为qPCR技术检测实践提供指导和帮助。本共识包括qPCR检测技术的样本选择、前处理、检测流程、性能验证、质量管理、常见问题和异常结果处理等多个临床实践重要部分，推荐意见基于国内外临床实践数据并结合我国国情，分为强烈推荐(证据充分且专家组达成一致共识，在检测条件充分的环境下优先推荐开展的措施)、推荐(证据较充分且专家组达成基本一致共识，基于特定实际检测条件推荐开展的措施)和不推荐3个等级。

一

样本选择与前处理

目前肿瘤分子病理检测常用样本主要包括福尔马林固定石蜡包埋组织(formalin－fixed paraffin－embedding, FFPE)样本(包括手术切除和活检组织样本)、细胞学样本和体液样本(包括外周血、脑脊液、浆膜腔积液上清液、唾液和尿液等)，应依据临床需求、样本可及性及qPCR检测平台性能选择合适的样本。

(一)样本选择

强烈推荐使用手术切除组织或活检组织FFPE样本。组织样本不可及时，推荐采用细胞学样本进行检测。若组织和细胞学样本均不可及，推荐外周血等体液样本进行循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)突变检测。

(二)样本前处理

不同类型样本的前处理应根据各自特点建立标准操作程序(standard operating procedure, SOP)，详尽规范样本采集、运输、接收/拒收、保存和前处理流程，确保样本符合后续检测要求。

1．组织学样本：

标本离体后应在30 min内浸泡于10~15倍体积的4%中性甲醛(10%福尔马林)固定液中，大样本应注意逐层切开以充分固定，根据样本大小和组织类型适当调整固定时间，一般不超过72 h。样本浸蜡和包埋温度一般在58~60 ℃，不宜过高。

2．细胞学样本：

包括胸/腹腔积液、心包积液和细针穿刺标本等，强烈推荐将细胞学样本制备成细胞蜡块，使用4%中性甲醛(10%中性福尔马林)固定液或者95%乙醇固定，后续操作可参照组织样本处理要求及病理质控。也可将细胞学样本涂片或液基细胞学制片，镜下评估肿瘤细胞数量及比例，对于质控合格的细胞学样本，收集细胞沉渣，直接裂解提取核酸。此外，浆膜腔积液离心后的上清液可作为一种补充检测样本，用于分子病理检测，但应关注其假阴性风险，必要时可与细胞沉渣的检测结果相互验证。

3．体液样本：

外周血是分子检测最常用的体液样本，主要通过分离血浆中ctDNA进行分子检测。可使用含有游离DNA保护剂和防细胞裂解剂的专用采血管，采集不少于10 ml的全血。前处理时，采用先低速后高速的二次离心法分离血浆。其他体液样本可参考外周血样本采集、保存和前处理方法。强烈推荐将体液样本与组织样本的前处理和核酸提取等操作分别在相对独立的物理空间(独立生物安全柜或实验室房间)进行。

(三)样本质量评估

在核酸提取前，应对组织和细胞样本的前处理过程、保存情况及细胞成分进行评估。对于体液样本，应对患者治疗情况及疾病状态进行评估。

1．组织或细胞学样本：

推荐使用2年以内的FFPE样本，病理医师须对肿瘤细胞含量进行评估，推荐采用肿瘤细胞不少于200个，且占比不少于20%的蜡块，避免使用强酸脱钙处理后的样本，避免选取存在组织自溶、退变、大片出血、明显坏死或结构不清等情况的蜡块。在应用qPCR检测结果辅助诊断时(如IDH1/2基因突变用于低级别胶质瘤与胶质细胞增生的鉴别诊断、BRAF基因突变用于甲状腺乳头状癌的鉴别诊断等)可备注可疑肿瘤细胞含量。肿瘤细胞含量低于质控标准时，应与临床医师和患者及时沟通，评估是否有条件重新采集样本；如果无法重新采集，可在获得患者知情同意后再继续检测，尽量富集肿瘤细胞，并在报告中注明质控情况及出现假阴性结果等潜在风险。目前获批的qPCR检测试剂盒的质控指标多是建立在检测大样本的场景之下，小样本(如粗针穿刺和活检夹取样本等)和细胞学样本的肿瘤细胞含量常低于试剂盒给出的有效检测范围，实验室可自行建立质控评价标准和检出限。

2．体液样本：

推荐治疗间期采集，如在化疗、放疗或手术治疗1~2周后采集。尽量避免在患者伴随其他疾病如严重感染或外伤时采集，以避免因正常细胞释放DNA对ctDNA稀释，造成假阴性结果。外周血应避免使用发生严重溶血或血脂过高等异常样本。

(四)样本获取、富集、运输与保存

FFPE样本切片前应保证切片机擦拭洁净无污染物，切片时每个样本使用单独的一次性刀片、一次性镊子和棉签等耗材，防止不同样本间交叉污染。对于肿瘤细胞占比