来源： 查看手机网址 浏览：2432 发布日期：2017-06-13 08:57:46【大 中小】

与二代测序仪比，三代测序仪完全是革命性的，正向着高通量、低成本、长读取长度的方向发展。它具有明显的几个优点：

（1）单分子测序,大大提高了样本的通量和检测的速度；

（2）RNA直接测序，大大降低了体外逆转录产生的系统误差；

（3）长片段测序，大大提高DNA聚合酶内在自身的延续性。

有三家公司推出的三代测序平台是比较有代表性的，其中比较知名的是单纳米孔测序和单分子实时测序两种平台，我们来看一下它们的技术背景。

Oxford Nanopore公司推出的基于纳米孔测序技术的测序平台包括MinION、PromethION和GridION（下图A，B，C）。

它的基本原理可以这样概述（上图D）：在充满了电解液的纳米级小孔两端加上一定的电压（一般为100～120 mV）时，可以很容易地测量通过此纳米孔的电流强度。纳米孔的直径（约2.6 nm）只能容纳一个核苷酸通过，在核苷酸通过时，纳米孔被核苷酸阻断，通过的电流强度随之变弱。

由于4种核苷酸碱基的空间构象不同，它们在通过纳米孔时，被减弱的电流强度变化程度也就有所不同。这样，由多个核苷酸组成的长链DNA或者RNA在电场的作用下由负极向正极方向移动并通过纳米孔时，检测通过纳米孔的电流强度变化，即可判断通过纳米孔的核苷酸种类，这样就实现了实时测序。纳米孔测序的DNA模板无需像二代测序技术那样进行扩增即可测序，因而具有读长长、实时、单分子等特点，并且可以极大降低测序成本。

Pacific BioSciences公司推出的单分子实时（single molecular real time，SMRT）DNA测序技术也是基于边合成边测序的原理。该技术主要特点是读长长，平均序列读长在10 kb以上，最长读长可达40 kb。它以SMRT Cell为测序载体进行测序反应。SMRT Cell是一张厚度为100 nm的金属片，一面带有15万个（2014年数据）直径为几十纳米的小孔，称为零模波导（zero-mode waveguide，ZMW），也可以简称为纳米孔。

测序时，系统将测序文库、DNA聚合酶和带有不同荧光标记的dNTP放置到纳米孔的底部进行DNA合成反应。DNA聚合酶分子通过共价结合的方式固定在纳米孔底部，通常一个纳米孔固定一个DNA聚合酶分子和一条DNA模板。加入DNA聚合反应所需底物——4种带有四色荧光标记基团的dNTP及缓冲液。根据模板链核苷酸顺序，相应的dNTP进入DNA模板链、引物和聚合酶复合物中发生链延伸反应，同时通过检测dNTP荧光信号，获得荧光信号图像，经计算分析获得DNA碱基顺序。每个SMRT Cell大约可以同时进行12万个以上的单分子测序反应。

A. PacBio Sequel测序仪。

B. PacBio RS II测序仪。

C. 测序反应ZMW孔（零模波导孔）的特殊结构，保证孔底部仅能固定单分子DNA聚合酶和单分子DNA，检测单次聚合反应的荧光信号。

D. PacBio测序原理：DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸碱基互补结合于DNA模板上；（1、2）结合于磷酸基团上的荧光信号释放；（3）DNA聚合酶前移至下一个碱基位置；（4）催化下一个聚合反应；（5）光系统实时检测聚合反应碱基的荧光信号。

SMRT技术区别于其他第二代测序技术的显著特点如下：

(1)测序文库不需要扩增，真正实现了“单分子测序”；

(2)用于检测标记的荧光基团与脱氧核苷酸（dNTP）的结合位置不是在碱基上，而是在5′端三磷酸基团的第3个磷酸基上，这样在dNTP与测序模板互补结合到测序引物上时发生缩合反应后，荧光基团就随着焦磷酸一起被切掉了，省去了如Illumina SBS测序方法中采用的去除碱基上荧光基团的步骤。当一个dNTP被加到DNA合成链的同时，它也进入了零模波导孔（ZMW）的荧光信号检测区，并在激光激发下发出荧光，光学系统记录所发出的荧光信号，将其转化为核苷酸种类，从而得到待测序列信息；

(3)零模波导孔是一个直径只有几十纳米的小孔，具有独特的光学特性，能够阻止可见激光完全透过，激光在进入零模波导孔后迅速衰减。这样，只有在靠近零模波导孔底部30 nm的区域内，激光才能进入并激发dNTP上的荧光基团发出荧光信号，这样就减少了测序的噪声荧光背景，从而提高了测序的准确度。

到目前为止，PacBio公司基于SMRT测序技术共推出了三款测序仪，第一款产品PacBio RS在2011年正式发布并商用；2013年4月发布了升级版PacBio RS Ⅱ；2015年2015年10月推出全新升级的三代测序仪PacBio Sequel测序系统。

Helicos，作为第三代测序仪的先驱——第一台单分子测序仪HeliScope正是美国Helicos公司的杰作，它的出现真正实现了单分子测序。阻碍HeliScope热卖的一个重要原因是售价太高,价格大约为99.9万美元。到2012年11月中旬，Helicos正式宣布破产。Oxford Nanopore，2012年2月份，Oxford Nanopore发布了一系列纳米孔DNA测序和蛋白质分析数据，并向外界展示了它的GridION TM系统和MinIONTM设备，产业化仍未实现。

如上所述，真正能够商业化应用的三代测序仪就是PacBio公司提供的仪器。我们可以对Sequel和RS II做一个简单的仪器性能比较：

从上表很容易就能发现，Sequel系统的读长、数据通量等关键性能都优于RS II，尤其是因为ZMW孔的数量相差约7倍，所以相同的运行时间内，Sequel比RS II产生的数据量也要高7倍。此外，Sequel仪器的体积比RS II更加小巧，Sequel也比RS II的价格低了很多，可谓是性价比之选。

当然，欧易作为一家负责任的生物技术服务公司，不会仅仅因为某仪器性价比高就进行强推，我们选择Sequel是因为它确实能够为研究人员带来更高质量的数据和更低的科研花费。目前RS II仪器已经停产，PacBio公司的工作重心和后续更新支持已全面转向Sequel系统相关。

也许不少人会有疑问，认为RS II毕竟已经推出很多年，Sequel会不会在优化和稳定性上有劣势？其实这样的担心是多余的，Sequel系统的性能优势已经十分明显。至于系统和试剂的优化，实际上RS II系统直到现在也一直在经历试剂的不断升级和相应的不断调试、优化；国内测序行业大规模购入Sequel系统也都发生在近几个月，而且最新版试剂P6-C4是今年2月份刚释出的，要知道，对每台Sequel测序仪的优化都是独特的，其最优性能的条件存在不同程度的差异，所以从某种程度上来说，我们都站在同一个起跑线上。以三代De novo组装为例，目前大基因组组装使用的FALCON软件其实是16年10月17日才在线发表的。

总之，PacBio的测序平台仍处于快速发展时期，无论试剂更新还是数据分析都是如此。各家三代测序仪的使用性能取决于使用者后期对仪器具有针对性的不断优化以及分析策略的不断优化，在仪器和试剂的每一次更新后都需要重新摸索最优条件。欧易生物的实验团队和分析团队将会配合研发部门为广大研究者带来更加优秀的三代测序体验。