激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM) 通常用于生成单、双和三标记荧光样品的数字图像。红色、绿色和蓝色 (RGB) 颜色的使用对于显示最多三个标记细胞的荧光探针的分布最为有用，当图像被着色并合并为一个不同的附加颜色时，任何共定位被观察到单个三色图像。

在本节中，我们展示了先前发布的使用流行的图像处理程序 Adobe Photoshop 生成三色共焦图像的方法的简化版本。此外，还讨论了用于显示共焦图像的三色合并协议的几种应用。请注意，这些数字方法不仅限于使用 LSCM 生成的图像，还可以应用于从许多不同来源导入 Photoshop 的数字图像。

荧光标记标本的图像是使用 Bio-Rad 型号 MRC-600 共聚焦激光扫描系统收集的，但大多数现代共聚焦仪器都能够简单地获取多色图像，包括尼康A1 HD25/A1R HD25和C2+共聚焦系统。选定的图像作为二进制文件从共聚焦显微镜的主机微型计算机传输到第二台计算机。图像以纯二进制文件 (RAW) 或标记图像文件格式 (TIFF) 文件的形式直接导入Adobe Photoshop。对于 RAW 文件，必须输入共焦图像的实际尺寸；例如，典型的图像大小为 768 x 512 像素，标头为 76 字节。标头特定于 Bio-Rad 专有PIC文件格式，可能因不同公司的成像系统而异。每个共聚焦公司都应该免费提供有关图像文件的信息。相比之下，TIFF 文件直接在 Photoshop 中打开。如有必要，可使用专为处理共焦文件而设计的市售程序或其他软件（如NIH Image，可在 Internet 上下载）将共焦图像文件转换为 TIFF 文件。存在许多可用于进一步处理共焦图像的程序。

通过将来自共聚焦显微镜的每个灰度图像粘贴到 RGB 彩色图像的红色、绿色和蓝色通道，在 Photoshop 中生成三色图像。在下面的过程描述中，Photoshop程序中各种命令的位置（以斜体表示）包含在每个操作之后。不同版本的 Photoshop可能会利用略有不同的命令结构或特定命令的菜单位置来执行相同的操作。Photoshop用户指南中提供了有关特定版本中特定操作的更多详细信息。

在Photoshop中打开三个灰度图像后，将构建一个空白的 RGB 图像（文件、新建）。图像必须与来自共聚焦显微镜的三个原始灰度图像具有相同的大小和像素分辨率；在此示例中，为 768 x 512 像素和 72 像素/英寸。可以确定和调整图像的大小和分辨率（图像、图像大小）。这个新的 RGB 图像应该是黑色的，因为荧光图像中的背景通常非常接近或处于黑色（黑色 = 0，白色 = 255）。出于美观目的，可以为背景选择另一种颜色，但应为图像所描绘的实际区域构建一个黑色遮罩，以便新的背景颜色不会干扰实际图像中的信息。

如果尚未打开，此时应打开通道面板（窗口、显示通道）。现在可以将三个灰度图像粘贴到新创建的 RGB 图像中。这是通过选择第一个灰度图像（选择、全部）并将其复制到新 RGB 图像（编辑、复制）所需的红色、绿色或蓝色通道中来实现的，方法是用鼠标单击新创建的 RGB 图像，然后然后在通道调色板列中的所需通道上。例如，对于红色通道，单击列中的红色窗口。最后，将灰度图像粘贴到 RGB 图像中（Edit, Paste）。图像现在将出现在频道中红色和 RGB 通道中的调色板列。现在使用相同的程序选择、复制和粘贴第二个和第三个灰度图像，并将它们分别粘贴到 RGB 图像的绿色和蓝色通道中。这些操作的结果是一个单一的三色合并图像（图 1，（a）和（b）），通过双击通道调色板列中的 RGB 图像显示。由于三个 8 位图像合并为一个24位图像，因此不会丢失来自三个原始源图像的位深度信息。图1中显示的果蝇胚胎图像每个都是从在三个不同的激发和发射波长下收集的相同的三个图像创建的，然后使用Photoshop将这些图像分配到不同的颜色通道，以生成两个版本的三色合并图像。

可以使用Levels(Image, Adjust, Levels)更改生成的合并图像中的颜色级别，以独立调整图像的红色、绿色和蓝色值。最后，出于演示目的，对图像的亮度和对比度（图像、调整、亮度/对比度）进行了微调。可以使用Variations (Image/Adjust/Variations）。此时可以使用嵌套在 Photoshop 中的图像处理功能来实现许多附加操作。特别有用的功能允许添加图形并将图像编译为多面板图形。如果将图形粘贴到图像中的单独图层而不是永久替换实际图像本身中的像素，则随后更容易编辑图形。

通过选择另存为（文件、另存为），图像将保存到计算机硬盘。图像通常以TIFF格式保存，并使用完全无损的 Lempel-Ziv-Welch (LZW) 方案进行压缩。其他压缩方法（如联合图像专家组 (JPEG) 压缩）可能会引入伪影，每次重新保存文件时可能会混合这些伪影。映像最终会存档到 CD-ROM 或 DVD-ROM。

可以使用高分辨率数字彩色幻灯片制作器或数字染料升华或其他彩色打印机直接从 Photoshop 中生成图像的彩色硬拷贝。这些设备作为插件直接从 Photoshop 进行控制，从而避免了将图像传输到另一个程序的需要。大容量存储的详细方面和硬拷贝的准备已在最近的文献中进行了广泛的审查。在染料升华打印机上打印时，单色图像通常缺乏对比度。通过像以前一样生成单个 RGB 图像并调整三个通道的相对级别，以便在所有通道中都有用于打印的信息（图像、调整、级别），可以在某种程度上克服该问题。

为了使用这种方法合并两个图像，第三个通道是空的。早期版本的 Photoshop 需要使用空白或黑色、空白背景图像作为第三个通道，并将红色图像置于红色通道中，绿色图像置于绿色通道中，空白图像置于 RGB 图像的蓝色通道中生成红/绿双标记图像。使用 Photoshop 3.0.5 版（及更高版本），可以将两个灰度图像粘贴到新创建的黑色 RGB 图像中。例如，要生成红色/绿色图像，将单独的图像粘贴到红色和绿色通道中（图2（a））。

三色合并图像中的颜色组合对于清楚地传达共聚焦显微镜收集的生物信息很重要。两种最常用的荧光团罗丹明和荧光素的真实发射颜色分别为红色和绿色，重叠的表达域为黄色。这些是在配备适当滤光片组的传统落射荧光显微镜中肉眼观察到的颜色，用于同时双标记成像，现在大多数显微镜制造商都可以买到。请注意，为共聚焦分析准备的三标记样品中的第三个通道通常以远红色发射，例如Cyanine-5(Cy5)，它在数字图像中方便地显示为蓝色，

使用Photoshop，通过将图像重新排列到不同通道来试验各种颜色组合是一项相对简单的任务。图1中显示的三色合并图像的两个版本作为示例。试样是果蝇在细胞胚盘期的胚胎，三重标记了三个分割蛋白质：毛状在绿色（图1（a））或红色（图1（b）），Krüppel在蓝色（图1（a））或绿色（图1（b）），和巨在红色（图1（a））或蓝色（图1（b））。不同的版本是通过使用拆分通道（窗口、显示通道、通道调色板下拉菜单、拆分通道）将三色 RGB 图像的分量灰度图像重新排列到不同通道中并使用合并通道（通道调色板下拉菜单）重新组合图像来实现的、合并通道、RGB 颜色模式）。使用指定通道输入框，可以将分量灰度图像分配给 RGB 图像的不同通道。因此，颜色并不总是对应于样品的实际颜色。

通过将同一图像的两个版本放入三个通道中的两个，将合并的第二个图像放在第三个通道中，可以在双标记图像中包含额外的颜色。例如，通过将相同的图像粘贴到红色和蓝色通道中以产生紫色来产生紫色和绿色图像，并将第二个图像放置在绿色通道中（图2（b））。其他颜色组合是红色和浅蓝色，其中浅蓝色包含蓝色和绿色通道；或蓝色和黄色，其中黄色包括红色和绿色通道（图2（c））。在这里，表达的重叠总是在图像中显示为白色，因为所有三个通道现在都对重叠信号做出贡献（图 2，（b）和（c）））。这里展示的不同的颜色组合利用果蝇 第三龄翼成虫盘标本双重标记为无翅（红色，绿色，或蓝色的图2（a）通过图2（c），分别地），和achaete在绿色，紫色，或黄色（分别为图 2 (a)至图 2(c)）。这些额外的颜色组合在制作多个双标记图像的多面板图时很有用，其中超过三种蛋白质的表达模式显示在单独的面板中，以便为每个蛋白质分配不同的颜色。请注意，共表达apterous和achaete的细胞核在图 2(a) 中显示为黄色，在图 2(b)和图 2(c)中显示为白色。

这种合并共焦图像的方法广泛用于绘制双标记和三标记标本中大分子的分布。由于免疫荧光的精细特异性，许多图像在被视为单一灰度图像时相当抽象，并且在许多情况下，只有在同时显示组织内已知地标的第二或第三张图像时才能解释.这是荧光原位杂交 (FISH)标记的细胞核的典型特征）。这些图像通常由大部分黑色背景上相对较少的亮像素组成，并且只有在收集整个细胞核或染色体扩散的第二个复染图像并与染色明亮的杂交中心合并时，才能解释这些图像。YOYO-1（最大激发491纳米）或 TOTO-3（最大激发642纳米）等二聚核酸染色剂是用于这些目的的极好复染剂。最近，使用组合标记策略将超过三个探针定位在同一条染色体上。在这里，已经开发了更复杂的图像合并和测量计算机方法来显示图像中的生物信息。

多标记共聚焦成像是发育生物学家研究细胞谱系和分析克隆的完美工具，其中一种或有时两种蛋白质的分布可用作标记在发育组织内绘制第三种感兴趣的蛋白质。此外，荧光标记的鬼笔环肽是一种方便的探针，可包含在用于成像细胞轮廓的三重标记策略中。染料的特定组合，例如用于标记细胞轮廓的罗丹明鬼笔环肽、用于标记细胞核（在Cy5通道上）的 TOTO-3和针对目标蛋白质的抗体（在荧光素通道上）可用于三重用于将蛋白质定位到细胞核、细胞质或细胞外基质的标记策略。

除了显示细胞内最多三个不同大分子的相对分布外，这种组合三个图像的方法还可用作三维 (3-D) 重建的替代方法，以显示样本内的深度信息。使用LSCM，来自标本内不同焦平面的一系列图像被收集到单个文件或z系列中。这些图像保持样本的 x、y和z配准，并且具有相同的尺寸和像素分辨率。从这样的z系列中选择三幅图像，作为单幅图像文件导出到 Photoshop中，然后像以前一样合并，以便将红色、绿色和蓝色颜色分配给标本内不同深度的结构（图3,（a)和(b)）。以类似的方式，可以从从共聚焦显微镜收集的延时电影序列文件中提取三个不同时间点的单个图像，并将其组合成三色合并图像。这些文件类似于 z 系列文件，只是时间取代了 z 维度。在这里，颜色差异用于总结单个图像中结构位置随时间的变化。

图 3(a) 中显示的图像是合并来自 z 系列投影的三个图像的结果，这些图像已着色，以便颜色被编码为样本中的深度。上皮细胞核显示为绿色，鳞状细胞的细胞核显示为蓝色和红色（在上皮细胞的不同水平）。标本是用碘化丙啶染色的整片蝴蝶蛹翅上皮。在图3（b）中，不同的结构被映射到深度在双标记图像中的整体处于发展的稍微后一阶段比的蝴蝶翅膀上皮的安装图3（a）。在这里，细胞核用 TOTO-3 标记，在上皮细胞核的更背侧位置出现的翼鳞用德克萨斯红鬼笔环肽标记。

Photoshop还可以为进一步处理图像提供桥梁，因为这些文件与许多其他程序兼容。例如，已使用 Photoshop 处理共聚焦图像序列，随后将其转移到商业上可用的变形程序并处理成动画短序列。这些序列可以使用 Adobe Premiere 进一步编辑和编译，并直接在计算机上使用 Apple QuickTime软件（也可以使用其他适用软件）作为数字电影查看，或导出到录像带以进行演示。

Photoshop 可用于许多不同的计算机平台，并且可以在大多数共聚焦显微镜的主机上运行。一些更复杂的共焦成像系统能够使用三检测器系统同时收集、合并和着色三幅图像，这可以避免使用 Photoshop。然而，通常需要使用额外的实验室微型计算机来操作共焦图像，以解放共焦工作站，以实现其主要目的是收集图像。此外，为了编译最终图形，可能需要将共焦图像与最终板中其他来源的图像相结合，在这种情况下，可在许多不同实验室计算机上使用的单个图像处理程序的多功能性是无价的。