2015–2017年流行病学调查显示，我国18岁及以上人群糖尿病患病率为11.2%[1]，给我国医疗系统带来沉重的负担。糖尿病的发病机制复杂，近年来研究[2]发现肠道菌群在糖尿病的发生、发展中发挥重要作用，尤其是肠道-慢性炎症[3-4]是其关键。肠道屏障损伤导致内毒素血症和炎症反应，干扰胰岛素在体内的信号传导，从而引发胰岛素抵抗和糖尿病[5]。

七味白术散由人参、白术、葛根、茯苓、木香、藿香、炙甘草组成。方中配伍有补有运、有升有降，可用于治疗气阴两虚所致的消渴病，研究发现[6-8]，七味白术散可通过调节肠道菌群减轻胰岛素抵抗，改善临床症状；同时可抑制糖尿病大鼠氧化应激反应，改善血糖水平。本研究通过观察七味白术散对糖尿病大鼠肠道屏障和TLR4/NF-κB信号通路的影响，阐明其改善胰岛素抵抗的作用机制，以期为糖尿病的治疗提供新思路。

SPF级SD雄性大鼠60只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。许可证号为SCXK (京) 2016-0006。自由饮食饮水，室温控制在20−24 ℃，相对湿度控制在40%−70%，12 h光照、12 h黑暗，昼夜循环。本研究所涉及的动物实验操作均由山东中医药大学附属医院实验动物伦理委员会批准(AWE-2019-029)。

七味白术散免煎颗粒，成分为葛根、党参、炒白术、藿香、木香、甘草和茯苓(质量比分别为1.5:0.7:1.5:1.5:0.6:0.3:1.5)，江阴天江药业有限公司，入库批号分别为：20040323、20041033、20050453、19100533、20031443、20040403及20060653。盐酸二甲双胍(0.5 g/片)，中美上海施贵宝制药有限公司。

标准饲料：41.47%的碳水化合物、14.42%的脂肪、21.06%的蛋白质。高糖高脂饲料：1%胆固醇、0.5%胆酸盐、15%猪油、20%蔗糖、63.5%基础饲料。链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)，济南贝塔生物科技有限公司；ZO-1单克隆抗体、occludin单克隆抗体、TLR4单克隆抗体、NF-κB单克隆抗体、β-actin单克隆抗体、goat anti-rabbit IgG，武汉贝因莱生物科技有限公司；IL-6、TNF-α酶联免疫试剂盒，上海创祥生物科技有限公司；BCA试剂盒，金克隆(北京)生物技术有限公司。泰尔茂血糖仪，泰尔茂(中国)投资有限公司；全自动生化分析仪，宁波瑞源生物科技有限公司。

参照相关研究制备糖尿病大鼠模型[9]：采用随机数字表法将大鼠分为空白组(n=10)和造模组(n=50)。空白组予标准大鼠饲料4周，造模组予高糖高脂饲料4周。造模组大鼠高糖高脂饲料喂养4周后禁食不禁水12 h，称重，予链脲佐菌素(溶于0.1 mol/L的枸橼酸缓冲液中，配制成1%的溶液，按30 mg/kg一次性腹腔注射)，空白组注射等体积的缓冲液。造模1周后，大鼠禁食不禁水8 h，采用尾静脉采血测空腹血糖≥11.1 mmol/L者确定为糖尿病大鼠。50只造模成功大鼠采用随机数字表法分为模型组、二甲双胍组、七味白术散高、中、低剂量组，每组10只。

按照人和动物间体表面积折算的等效剂量比值表换算，七味白术散低、中、高剂量组按照0.578、1.157、2.314 g/(kg·d)给药，二甲双胍组剂量按双胍0.150 g/(kg·d)给药。模型组和空白组均给予等量生理盐水灌胃。根据糖尿病饮食控制原则，所有大鼠均给予常规饲料喂养。各组大鼠均自由饮水，共灌胃4周。

记录大鼠一般生存情况，实验结束后，各组大鼠隔夜空腹称重，以10%水合氯醛(0.03 g/kg)腹腔麻醉，经腹主动脉取血，分离血清，置于−80 ℃冰箱保存备用。各组大鼠迅速取出1.5 cm中段结肠组织，置入4%多聚甲醛中固定保存，用于苏木精-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染色和免疫组化检测。各组大鼠迅速取出回肠组织，置于−80 ℃冰箱保存备用。

实验期间观察大鼠精神状态、饮食及活动情况、毛色、饮水量及尿量等。

取大鼠血清样本，采用全自动生化分析仪测FBG和FINS。

取大鼠血清样本，采用全自动生化分析仪测LPS；严格按照ELISA试剂盒说明书步骤操作，检测IL-6和TNF-α含量。

取大鼠结肠组织于4%的多聚甲醛溶液中固定后，用蒸馏水洗涤组织，放入70%乙醇中过夜；经脱水、透明、石蜡包埋、切片和封片后，进行HE染色，光学显微镜下检查大鼠回肠组织病理形态学变化。

取固定后结肠组织进行石蜡包埋，切片，常规脱蜡，阻断内源性过氧化物酶，血清封闭；滴加一抗至切片，4 ℃孵育过夜；滴加二抗至切片，室温孵育1 h；应用二氨基联苯胺(3, 3′-diaminobenzidine, DAB)液进行显色，完成后自来水冲洗，终止反应；复染细胞核，脱水封片；光镜下观察大鼠骨骼肌组织中蛋白表达情况，棕黄色为阳性染色；通过Image J分析并计算各组的平均光密度值。

采用蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测各组大鼠回肠组织ZO-1、occludin、TLR4、NF-κB蛋白表达量。用RIPA裂解液提取肠道中的蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度。取20 µg蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜至聚偏氟丙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜，5%脱脂奶粉室温封闭后，分别滴加一抗ZO-1 (稀释比1:1 000)、occludin (稀释比1:1 000)、TLR4 (稀释比1:1 000)、NF-κB (稀释比1:1 000)、β-actin (稀释比1:1 000)，4 ℃孵育，磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)洗涤后添加辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的羊抗鼠IgG二抗(稀释比1:10 000)，室温下孵育1 h，PBS洗涤后使用ECL化学发光法显影印迹，通过TANON GIS软件读取相关条带灰度值。以β-actin为内参计算目的蛋白条带的相对比值。

采用SPSS 25.0软件进行统计学分析。实验数据以平均数±标准差表示，采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

实验结束时，模型组大鼠死亡2只，七味白术散低剂量组死亡1只，其余各组大鼠无死亡。分析大鼠死亡原因：(1) 血糖过高引起各脏器功能衰竭；(2) 严重高血糖导致酮症酸中毒。

空白组大鼠精神状态好，活动自如，毛色白有光泽，体型肥胖。模型组大鼠活动少，精神萎靡，毛色无光泽，伴有多饮、多食和消瘦等症状。七味白术散低、中、高剂量组与模型组比较，各用药组大鼠上述症状均有不同程度的改善。二甲双胍组大鼠精神较模型组大鼠好转毛色无光泽，消瘦，多饮及多食症状不明显。

与空白组比较，造模后的各组大鼠空腹血糖值≥11.1 mmol/L，差异有统计学意义(P < 0.01)，说明模型组及各用药组大鼠均存在不同程度的胰岛素抵抗，符合糖尿病大鼠模型条件。与模型组比较，七味白术散低、中剂量组大鼠FBG有所下降，但差异无统计学意义(P > 0.05)；七味白术散高剂量组和二甲双胍组大鼠FBG均明显下降，差异有统计学意义(P < 0.05)，而且七味白术散高剂量组与二甲双胍组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。与模型组比较，七味白术散低、中、高剂量组和二甲双胍组大鼠FINS均明显降低，差异有统计学意义(P < 0.01)，而且七味白术散高剂量组与二甲双胍组比较差异无统计学意义(P > 0.05)。见表 1。

与空白组比较，糖尿病模型组及各用药组大鼠LPS、IL-6、TNF-α的水平均升高，差异有统计学意义(P < 0.01)。与糖尿病模型组比较，七味白术散低、中、高剂量组及二甲双胍组大鼠LPS、IL-6、TNF-α的水平均下降，差异有统计学意义(P < 0.01)，而且七味白术散高剂量组与二甲双胍组比较，差异无统计学意义(P > 0.05) (表 2)。

与空白组比较，糖尿病模型组大鼠可观察到肠道细胞排列紊乱，肠绒毛断裂不全且间隔稀疏，杯状细胞明显减少且分布不均，同时伴有中性粒细胞渗出，说明糖尿病大鼠结肠组织受损，可能存在炎症反应；与糖尿病模型组相比，七味白术散高剂量组及二甲双胍大鼠的肠绒毛排列较为整齐，完整性较好，结肠杯状细胞数量均有不同程度的恢复，中性粒细胞渗出减少(图 1)。

Occludin蛋白定位于细胞膜，与空白组比较，糖尿病模型组大鼠occludin蛋白的平均光密度值显著降低(P < 0.05)，而且occludin蛋白分布零星，存在多处断裂，连续性和完整性较差。与糖尿病模型组比较，七味白术散高剂量组及二甲双胍大鼠的occludin蛋白平均光密度值更高(P < 0.05)，occludin蛋白分布的连续性和完整性均有所改善(图 2和表 3)。

与空白组比较，糖尿病模型组及各用药组大鼠肠道组织ZO-1、occludin蛋白表达量均降低，差异有统计学意义(P < 0.01)，TLR4、NF-κB蛋白表达量均升高，差异有统计学意义(P < 0.01)；与糖尿病模型组比较，七味白术散高剂量组及二甲双胍组大鼠回肠组织ZO-1、occludin蛋白表达量均升高，差异有统计学意义(P < 0.01)，TLR4、NF-κB蛋白表达量均降低，差异有统计学意义(P < 0.01) (图 3和表 4)。

糖尿病是一种以低水平炎症状态为特征的代谢性疾病，这种炎症反应以增加炎症因子释放和炎症细胞浸润为特点。LPS来源于革兰阴性菌细胞壁外层，是一种重要的炎症刺激物，被认为是引起低水平炎症的始动因素。Burcelin等研究提示，LPS是连接肠道菌群、内毒素血症及慢性炎症的关键桥梁，是导致糖尿病发生的重要机制[10]。循环中的LPS在CD14协助下与CD14-Toll样受体结合，激活TLR-4，进而激活转录因子NF-κB，启动炎症因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等的表达，引起一系列非特异性炎症反应，导致胰岛素抵抗的发生[11]。本研究结果提示，与空白组对比，糖尿病大鼠LPS、IL-6、TNF-α的水平均升高，肠道组织TLR4、NF-κB蛋白表达量均增加。

肠道屏障主要由肠道上皮细胞和上皮细胞间紧密连接蛋白组成。细胞间紧密连接的结构成分可分为整合膜蛋白(occludin、claudins)、连接复合蛋白(ZO-1、ZO-2和ZO-3)和细胞骨架结构(微管、中间丝和微丝)，其中occludin和ZO-1因分布广泛，常用作检测肠道屏障功能和上皮通透性的重要标志物[12]。正常情况下，完整的肠道屏障允许营养物质有效跨细胞运输，同时防止细菌产物通过屏障吸收入血。但在高脂饮食、肠道菌群紊乱和肠道炎症的诱导下，肠上皮间隙过多积累的脂肪可以破坏肠上皮间的occludin和ZO-1紧密连接结构，导致LPS大量入血[13]。本研究结果显示，与空白组比较，糖尿病大鼠肠道组织ZO-1、occludin蛋白表达量降低。

糖尿病属于中医学“消渴病”范畴，关于消渴产生的原因，《景岳全书》[14]说：“消渴病，其为病之肇端，皆膏粱肥甘之变，皆富贵人病之而贫贱者少有也”。说明饮食不节可致消渴。从消渴产生的疾病机理来看，虽然消渴与五脏虚损均有关系，但脾虚在消渴的发病中占有重要位置。《灵枢·五变篇》云：“五脏皆柔弱者，善病消瘅”；《灵枢·本脏篇》曰：“脾脆，则善病消瘅易伤”[15]。赵献可《医贯·消渴论》[16]：“脾胃既虚，则不能敷布津液故渴”。七味白术散治脾胃久虚，呕吐泄泻，频作不止，精液苦竭，烦渴躁，但欲饮水，乳食不进，羸瘦困劣，被清代医家列为治疗消渴病的常用方[17]。多项研究证实，七味白术散可调整肠道微生态，减轻胰岛素抵抗[6-8]，降低血糖水平及改善临床症状[18]。七味白术散干预后，糖尿病大鼠LPS、IL-6、TNF-α的水平降低，TLR4、NF-κB蛋白表达量降低，结肠组织ZO-1、occludin蛋白表达量增加。说明七味白术散通过上调肠道紧密连接蛋白(ZO-1, occludin)的表达，修复肠道屏障功能，阻止过多的LPS入血，下调TLR4/NF-κB信号通路，减少IL-6、TNF-α等炎症因子的释放，从而减轻机体炎症反应，降低血糖水平。

糖尿病的发生发展与营养过剩、肠生态失衡、氧化应激、炎症及前炎症反应、线粒体功能障碍等有关，但这些研究往往局限于传统的肝脏、胰腺、骨骼肌、脂肪等单一组织中，对整个人体复杂系统的结构和功能重视不足。对于中药作用机制的探讨，不能局限于单一组织或通路，而应把握全局，从机体健康变化的整体出发。随着研究的不断深入，肠道微生态、脑肠肽、脑肠互动已经成为糖尿病发病机制研究的热点。七味白术散是否通过更深层次调控肠道微生态、肠道屏障功能及炎症反应，从而达到改善胰岛素抵抗，降低血糖水平的目的，将在后期研究中进行深入探讨。