一氧化碳（carbon monoxide, CO）气体中毒每年都有发生，严重的CO中毒可引起迟发性脑病，导致长期的神经精神症状，如人格改变、情感障碍、记忆障碍和认知功能障碍[1-2]。一氧化碳中毒迟发性脑病（delayed encepholopthy after carbon monoxide poisoning, DEACMP）是CO中毒最常见、最严重的并发症之一，发病率和病死率都很高。大约13%~50%的急性CO中毒患者康复后发生DEACMP[1, 3]。CO中毒具有引起机体缺氧和CO毒性的双重作用。在缺氧期间，脑白质可发生脱髓鞘和血管内皮细胞功能障碍，导致脑血管功能障碍。除缺氧外，关于DEACMP的机制还存在许多假说，包括炎症、免疫、脑细胞凋亡和直接神经元毒性假说[4-5]。高压氧（hyperbaric oxygen, HBO）治疗已被证明具有减轻脑内缺氧和DEACMP的有益作用，并可降低急性CO中毒后的病死率和致残率[6]。目前HBO治疗已做为一氧化碳中毒患者的标准治疗方法[7]，但HBO治疗后仍有部分患者出现DEACMP，高压氧治疗DEACMP的疗效及机制尚不清楚。因此，高压氧对DEACMP的防治作用仍存在争议，对DEACMP的治疗仍处于临床探索阶段。

从DEACMP的早期病理损害来看，线粒体功能障碍机制可能更能解释该病的特点。线粒体是具有双层膜结构的细胞器，也被称为“能量工厂”，是有氧呼吸产生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的主要来源。ATP及其水解物二磷酸腺苷是重要的能量载体，也是重要的神经递质。线粒体在调节能量动态平衡、细胞信号转导和细胞死亡等方面发挥着重要作用。缺氧可抑制线粒体呼吸链和氧化磷酸化过程，减少ATP生成。因此，线粒体可能在急性CO中毒和DEACMP的发生发展中起重要作用。

本研究建立急性CO中毒模型小鼠，通过观察小鼠中毒症状，结合行为学实验和髓鞘碱性蛋白（myelinbasicprotein，MBP）含量测定筛选DEACMP模型小鼠。利用生化方法探讨脑组织线粒体在DEACMP发生时和HBO治疗后的功能。本研究旨在探讨线粒体功能与DEACMP的关系以及高压氧对DEACMP线粒体功能的保护作用。因此，全面了解DEACMP的发病机制是寻找新的治疗策略的关键。

选用健康成年雄性昆明种小鼠225只（6~9周龄），购于北京维通利华实验动物科技有限公司[机构许可证：SCXK(京)2012-0001]。根据美国国立卫生研究院动物研究指南(NIH出版物第8023号，1996年修订的《实验动物护理和使用指南》)进行。用随机数字表法将动物随机分为3组：空气对照组（暴露于空气）75只，CO中毒组（暴露于CO）75只，HBO组(暴露于CO+HBO治疗)75只。将75只小鼠按第1、3、7、14、21天的时间点随机等分成5个亚组，每组15只。高压氧治疗于内蒙古医科大学附属医院高压氧科完成，其余实验部分均于内蒙古医科大学分子病理学重点实验室完成。

按照已发表的实验方案在CO中毒组和HBO组的小鼠身上进行[8-9]。两组小鼠通过腹腔注射纯品CO（99.9%，呼和浩特市紫瑞燃气有限公司），建立急性CO中毒动物模型。腹腔注射CO 100 mL/kg，分别于4、8、12 h后再注射50 mL/kg，共4次。染毒后观察症状，行为学实验和MBP检测证实DEACMP所致动物模型建立成功。空气对照组腹腔注射等量空气。

CO注射后即刻从尾静脉取血，使用改良的双波长COHB定量方法测定小鼠血中COHB浓度。每组随机抽取8只小鼠，将血样加入0.4 mol/L氢氧化铵20 mL中混合均匀，再加入次亚硫酸钠20 mg，充分混合。在10 min内用微板阅读器在535 nm和578 nm波长测量吸光度（A）。用公式计算血中COHB水平：COHB（%）=（2.44×A535 nm/A578 nm−2.68）×100%。

HBO组小鼠置于婴幼儿高压氧舱(武汉船舶设计研究所制造)[10]，先用纯氧洗舱。HBO治疗方案包括治疗压力为0.22 MPa（2.2 ATA），匀速加压和减压时间分别为15 min，稳压60 min，舱内温度保持在22~25 ℃。每天上午9点给予高压氧治疗，连续21次。空气对照组和CO中毒组也被放置在相同的舱内，并接受相同的实验程序，只是不进行高压氧处理。

从制备完成急性CO中毒动物模型次日开始，分别于中毒后第1天开始，每天同一时间对小鼠进行旷场实验、新事物识别实验及筑巢实验。

旷场实验旨在测试小鼠的活动能力和探索能力。在进行行为测试之前，小鼠在测试室中稳定1 h。测试是使用由4面墙和一个底部（27.5 cm×27.5 cm×20 cm）组成的开阔场地设备进行的，盒子地板被分成25个相等的正方形，放置在一个声音衰减室中，并用20 lux的光照明。将一只小鼠快速单独放置在盒子的中心，然后通过安装在视野中心上方的摄像头测量总站立时间和进入中心区的次数，记录5 min的行为。

新事物识别实验是一种广泛使用的行为学测试，用于评估学习和记忆能力，其基础是动物花更多的时间研究一个新的物体而不是一个熟悉的物体。新事物识别装置由一个透明塑料盒、两个相同的物体A、一个不同的物体B和一个视频记录系统组成。实验前一天，将小鼠放入一个40 cm×50 cm×50 cm的空箱中进行习服。在测试的第1天（熟悉阶段），小鼠接受5 min的时间来探索位于认知盒中相对角落的两个相同的物体。在第2天（24 h后，测试阶段），允许小鼠自由探索每个物体5 min。24 h后，将一个对象A替换为对象B，并允许小鼠探索5 min。记录每个物体的探索时间。根据以下公式计算辨别指数：辨别指数(花在新物体上的时间/在两个探索物体上的总时间)×100%。

筑巢实验是用于评估空间记忆能力。将小鼠单独放置在清洁的标准笼子中，让其适应单笼环境24 h。24 h后在笼中放入1 cm厚的刨花垫料，并在笼子中间放入一块近2.5 g/5 cm2的棉花筑巢材料，18 h后以四分制记录筑巢质量以评估筑巢行为[11]。得分表明了筑巢的质量：得分越高，表明筑巢质量越高。1分：没有巢；2分：棉花堆没有形成巢；3分：扁平的巢；4分：盖住老鼠的巢。

行为学实验结束后，用戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠取脑组织，即刻收集。解剖大脑半球的一部分，用10倍的0.1 MPBS（pH 7.4）冷冻，用电机驱动的特氟龙匀质机将小块脑组织均质化30 min。匀浆在4 ℃下以5 000 r/min的速度离心10 min，上清液等份并在−80 ℃下储存。蛋白质浓度测定采用Bradford法，以牛血清白蛋白为标准。在验证了最终的蛋白质浓度后，在所有样品中使用相同浓度的蛋白质。

根据制造商说明书，使用商用小鼠MBPELISA试剂盒（BA0094，武汉博斯特生物技术有限公司）对MBP水平进行定量。将标准物质稀释并装载，测试空白对照孔和样品孔，孵育30 min后，丢弃平板中的液体，用洗涤缓冲液洗涤。加入试剂A和B，在37 ˚C避光15 min后，在每孔中加入显色剂进行显色。最后加入50 µL停止液。每个样品的吸光度在450 nm的微型平板阅读器中测量。然后使用标准曲线测定样品中的MBP浓度。

用硫代巴比妥酸法和比色法测定MDA和ATP的含量，按厂家说明书(南京建城生物工程研究所A003-4-1和A095-1-1)进行。测定MDA，用波长532 nm的分光光度计读数，在636 nm波长处测定ATP的含量，最后将MDA和ATP的浓度换算为nmol/mg蛋白。

使用线粒体蛋白提取试剂盒(上海贝斯特生物科技有限公司)，按照制造商的方案分离线粒体。从脑组织中取出脑血管膜并切成1~2 mm的块，将切碎的组织在冰上裂解缓冲液中匀浆30 min，在4 ℃1 000 g的条件下离心5 min以去除碎屑。将所得上清液转移到新鲜的Eppendorf管中，并在4 ˚C 12 000 g再次离心15 min，以收集线粒体颗粒，用BCA蛋白分析试剂盒测定每个样品的蛋白质含量。所有步骤都严格在冰上进行，以确保高质量的制剂分离。

根据制造商的说明，使用mice CytCELISA试剂盒(武汉新启迪生物科技有限公司)检测线粒体中CytC的浓度。将相同浓度的蛋白质加载到96孔板中，并在室温下使用提供的CytC检测抗体孵育3 h。3 h后清洗微孔并用溶液A孵育1 h，然后用溶液B孵育1 h，去掉平板中的液体，用洗涤液冲洗，每孔加入停止液后，用微量比色板读数测量吸光度450 nm值，绘制CytC标准曲线，测定CytC浓度，结果以ng/μg蛋白质表示。本实验重复进行了3次。

使用阳离子荧光探针罗丹明123（Rh123，Sigma-Aldrich）测定MMP。将含有1 mL线粒体液和5 μg/mL Rh123染料溶液的微管在37˚C黑暗中孵育1 h，然后用1×PBS清洗。用流式细胞仪分析24 h内10 000个细胞的平均荧光强度，以此值作为MMP。

所有数据采用SPSS 19.0进行数据分析处理。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（x±s）表示。若数据符合正态分布且方差齐，采用ANOVA（方差分析），多重比较采用邦弗伦尼法。若方差不齐，采用韦尔奇统计量，多重比较采用塔姆黑尼法。不符合正态分布的计量资料以中位数（四分位数）[M(Q1, Q3)]表示，统计分析采用非参数检验（克鲁斯卡尔-沃利斯检验），多重比较采用邦弗伦尼校正法。以P < 0.05表示差异具有统计学意义。

首次腹腔注射CO气体10~15 min后，大多数小鼠表现出兴奋和轻度躁动，呼吸急促和沉重，呼吸幅度增加，陆续表现出躁狂，开始撞击笼边，部分小鼠出现四肢瘫软、抽搐和昏迷，甚至死亡。口鼻粘膜和耳、爪、尾皮肤呈樱桃红色。首次注射4 h内，CO中毒组小鼠死亡2只，HBO组小鼠死亡2只。在3次追加注射过程中，CO中毒组小鼠死亡3只，HBO组小鼠死亡2只。结果表明，空气对照组只有少数小鼠在注射空气后表现出烦躁外，无死亡。CO中毒组与HBO组小鼠在CO中毒前血液中COHB浓度均维持在5%以下。首次腹腔注射30 min后，COHB平均浓度约为65%。随后每次追加注射后，血液中COHB浓度均值可维持在50%以上。

CO中毒组的垂直站立次数各个时间点均显著低于空气对照组（P < 0.01）；与CO中毒组相比，HBO组小鼠垂直站立时间在第7天明显增加（P < 0.01），但低于空气对照组。CO中毒组小鼠进入中间格的次数逐渐少于空气对照组，在中毒第7天降至最低，之后又逐渐增加，第1天，P < 0.05，其余各点均P < 0.01；HBO组小鼠进入中间格的次数在第7、14天均明显多于CO中毒组（P < 0.01），但少于空气对照组。与空气对照组相比，CO中毒组的小鼠表现出活动能力的减低，而HBO治疗可以改善这些行为。

结果表明，CO中毒组小鼠对新事物的探索时间各个时间点均明显少于空气对照组（P < 0.01）；与CO中毒组相比，HBO组对新物体的探索时间在第7、14、21天均明显高于对熟悉物体的探索时间（P < 0.01），但少于空气对照组。因此，与空气对照组相比，CO中毒组小鼠的学习记忆能力明显受损，高压氧干预后，这种受损的学习记忆能力得到改善。

与空气对照组相比，CO中毒组小鼠的筑巢得分在第3、7、14、21天均逐渐降低（P < 0.01）。HBO组与CO中毒组比较，筑巢得分在第7天明显增加（P < 0.05），但少于空气对照组。结果提示，CO中毒组和HBO组均存在认知功能障碍，但HBO组认知功能障碍较CO组轻。与空气对照组相比，CO中毒组的小鼠在筑巢试验中表现出更大的损害。这表明空间记忆受到了损害，而HBO治疗改善了空间记忆。

CO中毒组小鼠脑组织中MBP含量逐渐降低，与对照组相比，第1天差异无统计学意义，其余各时间点均差异有统计学意义（P < 0.01）。结果表明，CO中毒小鼠脑组织中MBP含量降低，提示脑组织发生脱髓鞘反应，且HBO治疗后第3、7天的MBP含量显著高于CO中毒组（第3天，P < 0.05；第7天，P < 0.01）提示HBO治疗可减轻CO中毒所致的脑组织脱髓鞘病变。

观察CO中毒小鼠症状，结合行为学实验及脑组织MBP检测，共筛选出44只DEACMP模型小鼠，其中CO中毒组DEACMP小鼠，7 d组9只（60%），14 d组9只（60%），21 d组7只（47%）。HBO组DEACMP小鼠，7 d组7只（47%），14 d组6只（40%），21 d组6只（40%），组间差异有统计学意义（P < 0.05）。

3组小鼠第21天海马CA1区HE染色结果表明，空气组小鼠海马组织细胞排列紧密，形态正常，核仁居中，清晰可见，细胞核呈现淡蓝色；CO中毒组细胞排列松散、紊乱，细胞层数不完整，存在明显间隙，核仁不明显，细胞核可见固缩、碎裂、溶解，细胞脱失；HBO组可见细胞坏死程度介于CO中毒组及空气组之间，且明显轻于中毒组（见图 1）。

如表 1、2所示，与空气对照组相比，CO中毒组小鼠脑组织中的MDA含量在各个时间点均显著升高（P < 0.01），ATP含量在各个时间点均显著降低（P < 0.01）；与CO中毒组相比，HBO组小鼠脑组织中的MDA含量在各个时间点均显著降低（P < 0.01），ATP含量在第1天差异无统计学意义，第3、7、14、21天均显著升高（P < 0.01）。结果表明，CO中毒后小鼠脑组织内脂质过氧化物产生增加，脑组织内能量产生减少；HBO治疗能抑制CO中毒后脑组织的脂质过氧化反应，改善脑组织的能量产生。

如表 3所示，与空气对照组相比，CO中毒组线粒体CytC含量在各个时间点均明显减少(P < 0.01)。与CO中毒组相比，HBO组小鼠脑组织线粒体CytC含量在各个时间点均显著增加(P < 0.01)，且均低于空气组，提示CO中毒后小鼠脑组织内线粒体被破坏，CytC从线粒体内流失，经高压氧治疗后减轻了CO中毒对脑组织内线粒体的破坏，因此线粒体CytC释放减少。

如图 2所示，CO中毒组小鼠脑组织中MMP在各个时间点均明显低于空气对照组(P < 0.01)。但与CO中毒组相比，HBO治疗后第7、14、21天的MMP均显著高于CO中毒组（均P < 0.05），提示CO中毒后可引起脑组织MMP的降低，说明线粒体功能受损与MMP的下降密切相关。同时HBO治疗能显著抑制CO中毒小鼠脑组织中MMP的下降。高压氧对维持MMP有一定的保护作用。

探讨DEACMP的发病机制和高压氧治疗机制的关键是成功建立动物模型。目前，首先建立CO中毒小鼠模型的主要方法是腹腔注射CO或者是CO气体吸入法。腹腔注射CO的主要优点是操作简单、可控性强、影响因素少，可随时测定COHB浓度。这种方法虽与临床所见急性CO中毒的侵入途径不同，但中毒机制相符。在本研究中，使用了腹腔注射CO，结果显示，首次腹腔注射30 min后，COHB平均浓度约为65%。随后每次追加注射后，血液中COHB水平 > 50%，这样就造成了小鼠长时间重度CO中毒，这也是临床上急性CO中毒引起迟发性脑病的主要易发因素。DEACMP是指急性CO中毒患者在中毒症状缓解、意识恢复正常后，经过一段时间的“假愈期”后再度出现学习记忆能力的减退甚至痴呆等表现[12]。因此，在小鼠急性CO中毒后对其活动能力、学习记忆能力及认知能力的检测，是可以认定是否发生迟发性脑病的。

近年来，一些研究报道了DEACMP的病因涉及脱髓鞘的改变。最近的一项研究报道，DEACMP引起的脱髓鞘比单纯缺氧引起的脱髓鞘更严重，而且前者持续的时间更长。因此，本研究通过观察小鼠急性CO中毒症状，采用旷场实验、新事物识别实验、筑巢实验等行为学实验以及脑组织内MBP含量的测定来筛选DEACMP小鼠模型。本研究在CO中毒后第3、7、14、21天，CO中毒组与对照组相比，MBP含量均显著降低(P < 0.01)，提示脑组织发生脱髓鞘反应。新事物识别实验和筑巢实验出现严重的认知障碍(P < 0.01)，旷场实验表现出活动能力显著下降(P < 0.01)。这些数据表明成功建立了DEACMP小鼠模型[13]，并说明HBO治疗可以降低DEACMP的发病率。而且急性CO中毒的小鼠经过一段时间后才出现迟发性脑病，这一表现与临床上DEACMP患者出现的“假愈期”相符，同时也说明了急性CO中毒后7~21 d是引起迟发性脑病的好发时间段。与CO中毒组相比，HBO组在认知功能和活动能力方面有显著改善，并提高了MBP水平，提示HBO治疗抑制了DEACMP的发展。

MBP是一种被认为在神经系统脑组织髓鞘形成中起重要作用的主要蛋白质。脑组织中MBP含量的下降可能预示着严重的脑损伤。自20世纪80年代以来，MBP一直被认为是创伤和疾病中脑组织损伤的标志物[14-15]。基础实验也证实，HBO治疗可在小鼠模型中阻止MBP的降解和DEACMP的发展。在动物模型中，一些研究已经调查了HBO治疗对MBP和重新形成髓鞘的影响[16-17]。这与本研究是一致的。本实验数据显示，CO中毒后第3天至第21天，脑组织中MBP含量逐渐降低。然而与未经治疗的CO中毒组相比，HBO治疗改善了降低的MBP表达和脱髓鞘。因此，本研究认为是由于广泛的脱髓鞘病变导致了DEACMP相关的复杂的病理过程和不良的预后。MBP对髓鞘结构和髓鞘再生过程具有重要作用。在CO中毒、缺血缺氧后，脑细胞内氧自由基和过氧化产物显著增加，细胞膜脂质过氧化增强，导致神经细胞脱髓鞘和继发性神经细胞死亡[18-19]。CO中毒还可能导致MBP和MDA之间形成加合物。脂质过氧化产物MDA被认为是氧化应激的标志物，它是由脂质过氧化产生的，导致结构蛋白和细胞结构的破坏。在本研究中，与CO中毒组小鼠相比，HBO治疗有效地降低了脑组织中MDA的水平，表明HBO治疗通过减少氧化应激而改善了DEACMP的脑细胞损伤，阻止了DEACMP的发展。

机体在氧化应激过程中产生的脂质过氧化产物会导致线粒体功能障碍。研究者普遍认为线粒体是与能量产生有关的重要细胞器，也是细胞死亡途径的重要调节器。ATP含量可以直接反映线粒体功能的程度。有研究显示[20]，CO会引起氧化应激，部分原因是导致线粒体功能障碍。此外，CO还可能与线粒体细胞色素氧化酶结合，抑制线粒体呼吸，从而减少ATP的生成，直接或间接导致细胞损伤。有研究表明，HBO的分子效应可防止中枢神经系统的脂质过氧化，并保护暴露于CO的组织中的ATP水平，从而减轻损伤[21-22]。MMP是通过线粒体内膜两侧的质子或离子的浓度梯度形成的，这是线粒体正常生理功能的基本前提，高MMP是ATP生成的先决条件。既往报道是改变了MMP，可能导致氧化磷酸化和ATP浓度降低。本研究中，CO中毒组与对照组相比，小鼠脑组织中的ATP含量和MMP在各个时间点均显著降低，然而HBO治疗后ATP水平和MMP水平都有所升高，HBO治疗改善了线粒体的功能。在正常生理条件下，CytC很少穿透外膜，但当MMP减少时，线粒体膜的通透性增加，CytC可以从线粒体内膜释放到细胞质中[23]。研究还表明，线粒体CytC的释放是线粒体损伤的标志，也是细胞凋亡的主要途径之一，通过从线粒体释放CytC到胞浆而被激活[24-25]。如表 3所示，与对照组相比，CO中毒组小鼠的线粒体CytC在各个时间点均明显减少，HBO治疗显著减弱了CO诱导的线粒体CytC释放。因此，可以假设HBO通过抑制线粒体CytC的释放来减轻细胞的凋亡过程。

综上所述，HBO治疗可以显著改善DEACMP模型小鼠的运动行为和认知功能障碍，HBO治疗可降低DEACMP模型小鼠MDA水平，升高ATP水平和MMP，抑制线粒体CytC的释放。这些表明线粒体损伤参与了DEACMP的发生和发展，HBO治疗抑制了DEACMP的发生和发展，改善了DEACMP的症状，保护了急性CO中毒所致的线粒体损伤。

利益冲突  所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明  包金风、黄博雅：研究设计，数据收集及整理，统计学分析，文章撰写；宁荣霞：参与研究设计，技术指导，论文修改，统计学分析，研究经费支持；云霞、高士杰：数据收集，统计学分析；贾慧琼、胡潇红、李哲、陈钊晓：数据收集