ELISA试验方案（通用指南） |
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介绍
酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种基于微孔板的试验，用于检测和定量复杂混合物中的特定蛋白质。 夹心酶联免疫吸附试验中靶特异性蛋白的检测和定量通过使用高度特异性抗体完成，将靶蛋白（抗原）固定在微孔板上，间接检测靶蛋白是否存在。这种类型的捕获检测被称为夹心检测，因为被测分析物结合在两种主要抗体之间，每种抗体检测抗原的不同表位———捕获抗体和检测抗体。 搜索可用的抗体对和酶联免疫吸附测定试剂盒 搜索可用的酶联免疫吸附测定试剂 请查找以下使用96孔板进行标准夹心ELISA检测（比色（显色）和化学发光检测）的方案。 全部程序 将靶蛋白特异性捕获抗体附着在微孔板上添加与捕获抗体结合的靶蛋白的标准品和样品 洗去未结合的物质 添加与固定的靶蛋白结合的检测抗体 洗掉多余的检测抗体并加入辣根过氧化物酶偶联物添加辣根过氧化物酶底物间接检测结合蛋白 比色检测化学发光检测 比色夹心酶联免疫吸附试验方案 材料 透明96孔板（例如，MaxiSorp八连管，货号：468667）包被缓冲液（10 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4或50 mM碳酸盐缓冲液，pH 9.4，货号：28382）封闭缓冲液（检测缓冲液）（例如，ELISA检测缓冲液，货号：DS98200）洗涤缓冲液（三乙醇胺缓冲或含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲盐水，货号：28360或28352）孔板封膜机（例如，96孔板封膜，货号：15036）加样槽（例如ELISA试剂加样槽，货号：15075）捕获（包被）抗体检测抗体链霉亲和素-辣根过氧化物酶(如辣根过氧化物酶-偶联链霉亲和素，货号：N100）TMB底物（例如，TMB稳定显色剂，货号：SB01）终止液（1.8 NH2SO4，例如货号：SS03） 试验要求的其他材料 基于吸光度的微孔板酶标仪（如Multiskan FC酶标仪）蒸馏水或去离子水样品（见ELISA样品制备方案）方案提示关于全套ELISA缓冲液， Invitrogen抗体对缓冲液试剂盒，货号：CNB0011，包括：包被缓冲液（pH 7.4和pH 9.4）、检测缓冲液（封闭缓冲液）、洗涤缓冲液、稳定的TMB和终止溶液。 程序 用包被缓冲液稀释捕获抗体制备包被溶液。关于稀释建议，请咨询生产商。用每孔100 µL的包被溶液包被孔板。盖上孔板，在2–8℃温度下孵育过夜（12–18小时）吸掉各个孔液体，并每孔加200 µL>的洗涤缓冲液洗涤1次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。在室温下，每孔加入200 µL封闭缓冲液封闭1小时。抽吸、倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。在封闭缓冲液中制备标准品和样品稀释液。将100 µL标准品（一式两份）和样品加入指定的孔中。在室温下温和持续摇（~500 rpm）1小时。吸掉各个孔液体，并向每孔>加入200 µL的洗涤缓冲液洗涤5次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。通过在封闭缓冲液中稀释检测抗体来制备检测抗体溶液。对于抗体稀释建议，请参考生产商的说明。向每个孔中加入100 µL检测抗体溶液。在室温下温和持续摇（~500 rpm）2小时。吸掉各个孔液体，并在每孔>中加入200 µL的洗涤缓冲液洗涤5次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。用封闭缓冲液按1:5000比例稀释制成链霉亲和素-辣根过氧化物酶工作液。例如，为满足一个孔板的需要量，在9.998 mL封闭缓冲液中加入2 µL链霉亲和素-辣根过氧化物酶。在每个孔中加入100µL链霉亲和素-辣根过氧化物酶工作液。在室温下温和持续摇（~500 rpm）30分钟。吸掉各个孔中液体，并每孔>加入200 µL的洗涤缓冲液洗涤5次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。向每个孔中加入100 µLTMB底物溶液。在室温下孵育孔板30分钟。向每个孔中加入100 µL终止液。在加入终止液后30分钟内测量450 nm处的吸光度。使用对数-对数或4参数曲线拟合计算结果。方案提示为了确保获得精确可靠的结果，高质量的洗涤至关重要。 Thermo Scientific Wellwash洗板机使用自动安全地清洗孔板，是一款易于使用、可靠的微孔板清洗仪器，适用于常规ELISA应用。 化学发光夹心ELISA试验方案 材料 不透明96孔板（例如白色MaxiSorp微孔板，货号：437591）包被缓冲液（10 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4或50 mM碳酸盐缓冲液，pH 9.4，货号：28382）封闭缓冲液（例如，StartingBlock T20 PBS缓冲液，货号：37539或StartingBlock T20 TBS封闭缓冲液，货号：37543）洗涤缓冲液（三乙醇胺缓冲或含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲盐水，货号：28360或28352）化学发光底物（例如SuperSignal ELISA Pico化学发光底物，货号：37070）捕获（包被）抗体检测抗体 链霉亲和素-辣根过氧化物酶（检测抗体被生物素化）（例如辣根过氧化物酶偶联链霉亲和素，货号：N100）加样槽（例如ELISA试剂加样槽，货号：15075）孔板封膜机（例如，96孔板封膜，货号：15036） 试验要求的其他材料 化学发光微孔板读数仪（例如Luminoskan微孔板读数仪）蒸馏水或去离子水样品（见ELISA样品制备方案） 程序 用包被缓冲液中稀释捕获抗体制备包被溶液。关于稀释建议，请咨询生产商。用每孔100 µL的包被溶液包被孔板。盖上孔板，在2–8℃温度下孵育过夜（12–18小时）吸掉各个孔中液体，并用每孔加入200 µL>的洗涤缓冲液洗涤1次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。在室温下，每孔加入200 µL封闭缓冲液将孔板封闭1小时。抽吸、将孔板倒置在吸水纸上，轻轻拍打以去除残余液体。在封闭缓冲液中制备标准品和样品稀释液。将100 µL标准品（一式两份）和样品移至指定的孔中。在室温下温和持续摇（~500 rpm）1小时。吸掉各个孔中液体，并每孔>加入200 µL的洗涤缓冲液洗涤5次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。通过在封闭缓冲液中稀释检测抗体来制备检测抗体溶液。对于抗体稀释建议，请参考生产商的说明。向每个孔中加入100 µL检测抗体溶液。在室温下温和持续摇（~500 rpm）2小时。吸掉各个孔中液体，并每孔>加入200 µL的洗涤缓冲液洗涤5次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。如果检测抗体是辣根过氧化物酶偶联物，则进行步骤15。如果检测抗体是生物素化的：用封闭缓冲液按1:5000- 1:20000比例稀释制成链霉亲和素-辣根过氧化物酶工作液。例如，为满足一个孔板的需要量，在9.998 mL封闭缓冲液中加入2 µL链霉亲和素-辣根过氧化物酶。最佳稀释度应根据经验确定。如果检测抗体是生物素化的：在每个孔中加入100µL链霉亲和素-辣根过氧化物酶工作液。在室温下温和持续摇（~500 rpm）30分钟。如果检测抗体是生物素化的：吸掉各个孔中液体，并每孔>加入200 µL的洗涤缓冲液洗涤5次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。将等量的鲁米诺和稳定的过氧化物溶液混合，制成化学发光底物溶液的工作溶液。向每个孔中加入100 µL化学发光底物工作溶液。在室温下孵育1分钟。添加底物后1至5分钟，使用化学发光仪器测量相对信号值（~425 nm）。添加底物和孔板测量之间的时间间隔较长可能导致信号强度降低。方案提示为了确保获得精确可靠的结果，高质量的洗涤至关重要。 Thermo Scientific Wellwash洗板机自动安全地清洗孔板，是一款易于使用、可靠的洗板机，适用于常规ELISA应用。 方案提示当检测和定量低丰度蛋白质时，或者当样品和一次（捕获和检测）抗体有限时，建议使用化学发光检测法。 方案提示白色或黑色板可用于化学发光检测。白色板通常比黑色板显示更高的信号，当背景信号有问题时，应使用黑色板。 比色检测 比色夹心酶联免疫吸附试验方案 材料 透明96孔板（例如，MaxiSorp八连管，货号：468667）包被缓冲液（10 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4或50 mM碳酸盐缓冲液，pH 9.4，货号：28382）封闭缓冲液（检测缓冲液）（例如，ELISA检测缓冲液，货号：DS98200）洗涤缓冲液（三乙醇胺缓冲或含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲盐水，货号：28360或28352）孔板封膜机（例如，96孔板封膜，货号：15036）加样槽（例如ELISA试剂加样槽，货号：15075）捕获（包被）抗体检测抗体链霉亲和素-辣根过氧化物酶(如辣根过氧化物酶-偶联链霉亲和素，货号：N100）TMB底物（例如，TMB稳定显色剂，货号：SB01）终止液（1.8 NH2SO4，例如货号：SS03） 试验要求的其他材料 基于吸光度的微孔板酶标仪（如Multiskan FC酶标仪）蒸馏水或去离子水样品（见ELISA样品制备方案）方案提示关于全套ELISA缓冲液， Invitrogen抗体对缓冲液试剂盒，货号：CNB0011，包括：包被缓冲液（pH 7.4和pH 9.4）、检测缓冲液（封闭缓冲液）、洗涤缓冲液、稳定的TMB和终止溶液。 程序 用包被缓冲液稀释捕获抗体制备包被溶液。关于稀释建议，请咨询生产商。用每孔100 µL的包被溶液包被孔板。盖上孔板，在2–8℃温度下孵育过夜（12–18小时）吸掉各个孔液体，并每孔加200 µL>的洗涤缓冲液洗涤1次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。在室温下，每孔加入200 µL封闭缓冲液封闭1小时。抽吸、倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。在封闭缓冲液中制备标准品和样品稀释液。将100 µL标准品（一式两份）和样品加入指定的孔中。在室温下温和持续摇（~500 rpm）1小时。吸掉各个孔液体，并向每孔>加入200 µL的洗涤缓冲液洗涤5次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。通过在封闭缓冲液中稀释检测抗体来制备检测抗体溶液。对于抗体稀释建议，请参考生产商的说明。向每个孔中加入100 µL检测抗体溶液。在室温下温和持续摇（~500 rpm）2小时。吸掉各个孔液体，并在每孔>中加入200 µL的洗涤缓冲液洗涤5次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。用封闭缓冲液按1:5000比例稀释制成链霉亲和素-辣根过氧化物酶工作液。例如，为满足一个孔板的需要量，在9.998 mL封闭缓冲液中加入2 µL链霉亲和素-辣根过氧化物酶。在每个孔中加入100µL链霉亲和素-辣根过氧化物酶工作液。在室温下温和持续摇（~500 rpm）30分钟。吸掉各个孔中液体，并每孔>加入200 µL的洗涤缓冲液洗涤5次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。向每个孔中加入100 µLTMB底物溶液。在室温下孵育孔板30分钟。向每个孔中加入100 µL终止液。在加入终止液后30分钟内测量450 nm处的吸光度。使用对数-对数或4参数曲线拟合计算结果。方案提示为了确保获得精确可靠的结果，高质量的洗涤至关重要。 Thermo Scientific Wellwash洗板机使用自动安全地清洗孔板，是一款易于使用、可靠的微孔板清洗仪器，适用于常规ELISA应用。 化学发光检测 化学发光夹心ELISA试验方案 材料 不透明96孔板（例如白色MaxiSorp微孔板，货号：437591）包被缓冲液（10 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4或50 mM碳酸盐缓冲液，pH 9.4，货号：28382）封闭缓冲液（例如，StartingBlock T20 PBS缓冲液，货号：37539或StartingBlock T20 TBS封闭缓冲液，货号：37543）洗涤缓冲液（三乙醇胺缓冲或含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲盐水，货号：28360或28352）化学发光底物（例如SuperSignal ELISA Pico化学发光底物，货号：37070）捕获（包被）抗体检测抗体 链霉亲和素-辣根过氧化物酶（检测抗体被生物素化）（例如辣根过氧化物酶偶联链霉亲和素，货号：N100）加样槽（例如ELISA试剂加样槽，货号：15075）孔板封膜机（例如，96孔板封膜，货号：15036） 试验要求的其他材料 化学发光微孔板读数仪（例如Luminoskan微孔板读数仪）蒸馏水或去离子水样品（见ELISA样品制备方案） 程序 用包被缓冲液中稀释捕获抗体制备包被溶液。关于稀释建议，请咨询生产商。用每孔100 µL的包被溶液包被孔板。盖上孔板，在2–8℃温度下孵育过夜（12–18小时）吸掉各个孔中液体，并用每孔加入200 µL>的洗涤缓冲液洗涤1次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。在室温下，每孔加入200 µL封闭缓冲液将孔板封闭1小时。抽吸、将孔板倒置在吸水纸上，轻轻拍打以去除残余液体。在封闭缓冲液中制备标准品和样品稀释液。将100 µL标准品（一式两份）和样品移至指定的孔中。在室温下温和持续摇（~500 rpm）1小时。吸掉各个孔中液体，并每孔>加入200 µL的洗涤缓冲液洗涤5次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。通过在封闭缓冲液中稀释检测抗体来制备检测抗体溶液。对于抗体稀释建议，请参考生产商的说明。向每个孔中加入100 µL检测抗体溶液。在室温下温和持续摇（~500 rpm）2小时。吸掉各个孔中液体，并每孔>加入200 µL的洗涤缓冲液洗涤5次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。如果检测抗体是辣根过氧化物酶偶联物，则进行步骤15。如果检测抗体是生物素化的：用封闭缓冲液按1:5000- 1:20000比例稀释制成链霉亲和素-辣根过氧化物酶工作液。例如，为满足一个孔板的需要量，在9.998 mL封闭缓冲液中加入2 µL链霉亲和素-辣根过氧化物酶。最佳稀释度应根据经验确定。如果检测抗体是生物素化的：在每个孔中加入100µL链霉亲和素-辣根过氧化物酶工作液。在室温下温和持续摇（~500 rpm）30分钟。如果检测抗体是生物素化的：吸掉各个孔中液体，并每孔>加入200 µL的洗涤缓冲液洗涤5次。洗涤后，倒置孔板并在吸水纸上轻轻拍打以清除残余液体。将等量的鲁米诺和稳定的过氧化物溶液混合，制成化学发光底物溶液的工作溶液。向每个孔中加入100 µL化学发光底物工作溶液。在室温下孵育1分钟。添加底物后1至5分钟，使用化学发光仪器测量相对信号值（~425 nm）。添加底物和孔板测量之间的时间间隔较长可能导致信号强度降低。方案提示为了确保获得精确可靠的结果，高质量的洗涤至关重要。 Thermo Scientific Wellwash洗板机自动安全地清洗孔板，是一款易于使用、可靠的洗板机，适用于常规ELISA应用。 方案提示当检测和定量低丰度蛋白质时，或者当样品和一次（捕获和检测）抗体有限时，建议使用化学发光检测法。 方案提示白色或黑色板可用于化学发光检测。白色板通常比黑色板显示更高的信号，当背景信号有问题时，应使用黑色板。仅供科研使用，不可用于诊断目的。 |
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