Western Blot 常见问题汇总分析 - 丁香通 |
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电泳中的问题 出现问题 原因 条带呈笑脸状 (︶) 凝胶不均匀冷却,中间冷却不好;迁移过快,电泳系统温度偏高。 条带呈皱眉状 (︵) 可能是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡, 或者凝胶两边聚合不完全。 拖尾 样品溶解不好。 纹理(纵向条纹) 样品中含有不溶性颗粒,电泳前将样品离心去除颗粒。 条带偏斜 电极不平衡或者加样位置偏斜。 条带两边扩散 加样量过多。 Western blot 结果中背景 可能的原因 建议 抗体浓度太高 一抗或二抗浓度太高会导致高背景,增加抗体稀释倍数。 一抗孵育的温度偏高 建议 4℃ 结合过夜。 使用的封闭液不兼容 对比不同的封闭缓冲液。 非特异性位点封闭不足 优化封闭缓冲液,最好的封闭缓冲液具有系统依赖性; 提高封闭液中蛋白的浓度; 优化封闭时间和/或温度;室温封闭至少 1 h 或者 4°C 封闭过夜; 在封闭液中加入 Tween-20,Tween-20 的终浓度为 0.05%。 封闭液中与其它蛋白发生抗体的交叉反应 换一种不同的封闭液; 不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭,牛奶含生物素; 交叉反应的检测:封闭一张干净的膜,与抗体一起孵育,然后用超感应化学发光底物检测。 洗膜不充分 降低 HRP 结合物的浓度; 增加洗涤次数和使用洗膜缓冲液的体积; 如果洗涤液中无 Tween-20,添加 Tween-20 使其终浓度为 0.05%。 膜在实验过程中干过 实验过程中要注意保持膜的湿润。 选择的膜容易产生高背景 一般硝酸纤维素膜(NC)的背景会比 PVDF 膜低。 膜的曝光时间过久 缩短印迹膜曝光到胶片的时间; 在孵育过程中始终进行震荡。 膜被污染 小心夹膜——损坏膜可能导致非特异性结合; 不能空手持膜,始终带干净手套或用镊子。 缓冲液污染或结块沉淀 制备新的缓冲液。 HRP 处产生聚集体 用 0.2μm 过滤器过滤结合物。 结合可产生斑点 用一种新的高质量的结合物。 缓冲液中有污染 使用新的缓冲液; 缓冲液使用前过滤。 操作设备被污染 保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁,无外缘污染物; 保证在转膜后没有凝胶留在膜上,蛋白可能黏在胶上导致背景。 Western blot 结果中信号弱或无信号 可能的原因 建议 蛋白未转到膜上 转膜结束后,用总蛋白染色剂染胶来确定转膜效率;(注:总蛋白染色剂可能检测不到低量的抗原。) 确保转膜过程中胶与膜完全接触; 确保转印夹层排布正确; 确保按照膜的制造商的使用说明润湿膜; 确保转印部件在电印迹过程中未过热; 使用正对照和/或分子量 Marker; 可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流优化转印时间和电流。 蛋白未完全结合到膜上 在转膜缓冲液中加入 20% 的甲醇促进结合。低分子量的抗原可能会穿过转印膜,需使用小孔径的膜进行。 一抗、二抗等不匹配 订购试剂时认真选取一抗与组织种属,一抗与二抗或/和底物与酶系统之间相匹配的抗体及底物; 可通过设置内参可以验证二级检测系统的有效性。 一抗或/和二抗浓度低 增加抗体浓度; 延长抗体孵育时间; 抗体与靶蛋白的亲和力可能很小; 抗体可能失活;可用斑点印迹检测其活性。 一抗或/和二抗浓度太高 使用太多一抗或二抗可能导致底物迅速耗竭,呈现出很弱的信号; 至少成倍稀释一抗/二抗(可 4~10 倍)。 一抗失效 使用有效期内的抗体,分装保存,避免反复冻融取用,工作液现用现配。 过度封闭 使用含 0.5% 脱脂奶粉或无脱脂奶的抗体稀释液; 试用不同的封闭液; 减少封闭时间。 洗膜过度 洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用 0.05% 的弱去垢剂 Tween-20。 缓冲液中含有叠氮钠 叠氮钠是一种 HRP 的抑制剂,缓冲液不能使用叠氮钠作为防腐剂。 曝光时间太短 延长胶片的曝光时间(注意:超感应化学发光底物会持续发光至少 6 个小时)。 底物孵育时间太短 在使用超感应底物时需进行 5 分钟的底物孵育。 酶或底物失活 超感应化学发光底物和超感应 west 膜室温状态下化学底物可保存至少 12 个月,超感应免疫膜化学发光底物可保存至少 6 个月; 为衡量底物的活性,准备一个小量的工作液在一个暗室内,加入少量的 HRP 结合物,会观察到绿光。如果未检测到光,底物或 HRP 结合物均有可能失活; 确保两底物无交叉污染两种底物试剂的污染可能导致活性下降。 膜可以修复剥离重新用探针检测 在膜剥离过程中可能会有抗原损失或变性; 优化剥离程序; 如有必要可重新用探针检测; 避免在同一张膜上重复进行探针检测。 在膜上消解抗原 封闭底物可能含有蛋白水解酶活性(如明胶)。 印迹膜保存时蛋白降解 准备一张新的印迹膜。 Western blot 结果中杂带较多或特异性条带位置不对 可能的原因 建议 细胞传代次数过多,使其蛋白表达模式的分化 使用原始或传代少的细胞株,或平行实验。 体内表达的蛋白样本具有多种修饰形式:乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化、糖基化等,本身可以呈现多条带 查阅文献或进行生物信息学分析,获得蛋白序列的修饰位点信息,通过去修饰确定蛋白实际大小。 目的蛋白有其它剪切本 查阅文献或生物信息学分析可能性。 样本处理过程中目的蛋白发生降解 使用新鲜制备的标本,并使用蛋白酶抑制剂; 样本处理时在冰上操作。 上样量过高,太敏感 适当减少上样量。 一抗不纯 使用单克隆或亲和纯化的抗体,减少非特异条带。 一抗或者二抗浓度偏高 降低抗体浓度,增加二抗对照 ;选择特异性更强,只针对重链的二抗。 一抗特异性不高 重新选择或制备高特异性的抗体。 蛋白存在二聚体或多聚体 SDS-PAGE 电泳上样前,煮沸 10 min,以增强蛋白质解聚变性。 其它现象 出现现象 产生原因 解决方案 膜上多处出现黑点或黑斑 转膜时有气泡或抗体分布不均 抗体与封闭剂结合抗体 尽量去除气泡,抗体孵育时保持摇动。 过滤封闭剂。 反白(条带显白色) HRP 结合物浓度过高 至少成倍稀释一抗/二抗 (可 4~10 倍)。 靶蛋白分子量偏低或偏高 SDS-PAGE 胶浓度选择不合适 调整胶浓度,分子量大的蛋白用低浓度胶,分子量小的蛋白用高浓度胶。 题图来源:shutterstock 正版图库 编辑: weicf 来源:丁香园 |
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