近年来，许多非常规酵母因其具有优良的生化代谢特征而受到人们的广泛关注。解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)就是一种具有典型代表性的非常规酵母。该酵母是严格好氧菌，同时也是一种“安全级” (Generally Regarded as Safe，GRAS)的微生物[1]。与常规酵母——酿酒酵母相比，解脂耶氏酵母具有一些明显不同的代谢特点，显示出更好的工业应用前景：(1) 该酵母自身具有将多种廉价生物质原料快速转化为各种高附加值化学品如柠檬酸、琥珀酸的代谢能力，生产基于脂质的油性化学品的能力也较强[2]。(2) 该酵母对油脂类物质具有较强的降解能力，因此可用于对废油污染的生物修复[3]。(3) 该酵母具有更高效分泌蛋白质和有机酸(如α-酮戊二酸和琥珀酸)的能力[4]。(4) 该酵母对生长条件的要求更低，在各种碳源、pH和盐度条件下均可生长[5]。(5) 该酵母并不受葡萄糖效应的影响，因此不会进行有氧酒精发酵[6]。随着解脂耶氏酵母全基因组序列的公布以及基因表达载体、遗传转化方法、合成生物学元件和基因编辑技术的快速发展，该酵母已经成为目前代谢工程及合成生物学研究中备受关注且极具潜力的非模式微生物底盘细胞之一。

植物天然产物(Plant-Derived Natural Products)是指植物体内具有生物学活性的一类次生代谢产物。植物种类和生态环境的多样性造就了植物天然产物结构和性能的丰富多样性[7]，因此，植物天然产物的种类和数量非常巨大，目前已知的种类主要包括萜类、生物碱类、甾体类、黄酮类及酚类等。其中，萜类(Terpenoids)又是植物天然产物中数量最多、分布最广的一大类物质，其是以异戊二烯为结构单元的一系列化合物的统称。多数萜类化合物具有药理学和生物学活性，也可以作为香料、药物、色素等精细化学品的重要生产原料，因此在食品、药品和化工等多个领域应用广泛[8]。目前，萜类化合物的工业生产主要还是通过直接从植物中提取而得，但是这一生产方式存在诸多弊端，如植物资源稀缺、目标物质含量低、分离纯化效率低等。利用化学合成法也能够生产萜类化合物，但这种生产方式同样存在环境污染严重、能源消耗大、设备要求高、原料利用率低等问题。随着人们对健康、能源和环境等问题关注度的提高，利用微生物代谢工程及合成生物学技术实现萜类化合物的绿色生产就成为了一个研究热点。相比植物提取法和化学合成法，这种微生物合成法具有反应条件温和、低碳环保和可持续发展等优点，因此具有广阔的发展前景。近年来，随着微生物代谢工程及合成生物学等相关技术的突破性发展，利用微生物合成法生产萜类化合物有望成为替代植物提取法和化学合成法的一种有效策略。

解脂耶氏酵母正在成为代谢工程及合成生物学领域中一种重要的新型非模式微生物底盘细胞。而且，与大肠杆菌相比，解脂耶氏酵母具有完整的内膜系统和与植物相类似的蛋白质翻译后修饰系统，更适合植物源蛋白质的表达；除此之外，与大肠杆菌和酿酒酵母相比，解脂耶氏酵母属于典型的产油酵母，细胞内脂肪酸(Fatty Acid)、脂酰辅酶A (Fatty Acyl-CoA)以及乙酰辅酶A (Acetyl-CoA)的积累量较高[2]，因此，该酵母在生产植物萜类化合物(乙酰辅酶A衍生物，Acetyl-CoA Derived Products)方面具有明显优势，发展前景广阔。有鉴于此，本文对近年来以解脂耶氏酵母作为底盘细胞异源生产植物萜类化合物的有关实例进行了系统的总结和梳理，并对相关发展前景进行了分析，以期为从事相关研究科研人员开辟新的实验思路提供依据。

如图 1所示，解脂耶氏酵母自身具有MVA途径(Mevalonate Pathway)，可将胞内的乙酰辅酶A (Acetyl-CoA)转化生成异戊烯基焦磷酸(Isopentenyl Pyrophosphate，IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(Dimethylallyl Pyrophosphate，DMAPP)。IPP和DMAPP又在法尼基焦磷酸合酶(Farnesyl Pyrophosphate Synthase，FPPS)/香叶基香叶基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl Pyrophosphate Synthase，GGPPS)作用下缩合成了香叶基焦磷酸(Geranyl Pyrophosphate，GPP)、法尼基焦磷酸(Farnesyl Pyrophosphate，FPP)和香叶基香叶基焦磷酸(Geranylgeranyl Pyrophosphate，GGPP)[9-10]。解脂耶氏酵母细胞内源产生的GPP、FPP和GGPP就是各种萜类化合物生物合成的重要前体物质。近年来，研究者们利用代谢工程及合成生物学技术已实现了多种萜类化合物合成途径在解脂耶氏酵母底盘细胞中的重构与优化(表 1)。例如，外源引入的橙花基焦磷酸合酶(Neryl Pryophosphate Synthase 1，NDPS1)还可催化IPP和DMAPP转化生成橙花基焦磷酸(Neryldiphosphate，NPP)。NPP和GPP都可以作为植物源柠檬烯合酶(LS)的底物，进一步转化为单萜化合物——柠檬烯。以GPP为底物，异源表达的芳樟醇合酶(LIS)可将其转化生成芳樟醇(Linalool)。以FPP为底物，异源表达的α-法尼烯合酶(α-FS)可将其转化为α-法尼烯(α-Farnesene)。以GGPP为底物，通过引入番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶(CarRP)和八氢番茄红素脱氢酶(CarB)，可产生番茄红素(Lycopene)和β-胡萝卜素(β-Carotene)。与此同时，FPP可在内源酶催化下转化为角鲨烯和2, 3-氧化角鲨烯，进一步引入异源羽扇豆醇合酶(RcLUS)、细胞色素P450氧化酶(CYP)、细胞色素P450还原酶(CPR)后可获得终产物桦木酸(Betulinic Acid)。

柠檬烯(Limonene)是具有柑橘香味的一种功能性单萜，也是被美国FDA鉴定为安全的化合物[21]，化学式为C10H16。柠檬烯是一种广泛存在于植物中的天然产物，目前已在300多种植物中发现有柠檬烯的存在[22]。柠檬烯具有多种多样的应用价值，因此每年全世界的产量超过5万t[23]。其应用价值主要体现在以下几个方面：(1) 柠檬烯是一种环状烃，被评估为最有生物燃料潜力的物质[24]；(2) 柠檬烯是紫苏醇、香芹醇和薄荷醇等物质的重要前体化合物[25]，这些产物不仅可以用作高级香精香料，还有很高的药用价值[11]。(3) 柠檬烯本身也是最有希望可以被开发为抗癌药剂的单萜类化合物，尤其是用于乳腺癌的治疗[26]。正是因为柠檬烯具有的巨大应用潜力，众多研究者近年来纷纷利用解脂耶氏酵母作为底盘细胞进行异源生产柠檬烯的研究，并取得了诸多成果。

2016年，Cao等[11]将经密码子优化的人工dLS基因(编码d-柠檬烯合酶)整合到解脂耶氏酵母原始菌株Po1f中，但并未发现有柠檬烯的产生，因此推断这是由于缺少前体物质NPP的缘故。为了解决该问题，他们又将经过密码子优化的NDPS1基因(编码橙花基焦磷酸合酶)整合到Po1f菌株中，通过NDPS1基因和dLS基因的同时表达最终得到了能够成功生产d-柠檬烯的解脂耶氏酵母工程菌株，这是解脂耶氏酵母中异源生产柠檬烯的首次报道，这一成果也为后续科研人员利用解脂耶氏酵母生产各类柠檬烯衍生物奠定了基础；为了进一步提高柠檬烯的产量，Cao等发现过表达MVA途径中的HMG1基因(编码羟甲基戊二酰辅酶A还原酶)和MK基因(编码甲羟戊酸激酶)时可以大幅度增加柠檬烯的产量，因此这2个基因被认定是解脂耶氏酵母中柠檬烯合成路径中的关键限速酶基因；他们对工程菌株的发酵条件进行优化的结果发现：在添加4 g/L丙酮酸、8%十二烷的YPD培养基中，d-柠檬烯产量达到最高(23.56 mg/L、1.36 mg/g-DCW)[11]。

2019年，Cheng等[12]发现MVA途径的优化和柠檬烯生物合成途径的重新设计能够进一步提高解脂耶氏酵母异源生产柠檬烯的能力，通过在解脂耶氏酵母Po1f菌株中共同过量表达tNDPS1基因(编码截短的橙花基焦磷酸合酶)、tdLS基因(编码截短的d-柠檬烯合酶)、HMG1基因和MK基因并额外增加tdLS基因的拷贝数，成功提高了d-柠檬烯的产量；紧接着，通过筛选解脂耶氏酵母生产柠檬烯的最适碳源和辅助碳源，发现在以甘油为主要碳源、柠檬酸盐为辅助碳源的培养基中，d-柠檬烯的产量达到最高；最后，在优化后的培养基中进行补料分批发酵，解脂耶氏酵母工程菌株最终产生了165.3 mg/L d-柠檬烯，这也是迄今为止在解脂耶氏酵母中合成d-柠檬烯的最高产量[12]。

2019年，Pang等[13]将经密码子优化的dLS基因(编码d-柠檬烯合酶)和lLS基因(编码l-柠檬烯合酶)分别整合到解脂耶氏酵母Po1g KU70Δ亲本菌株(该菌株中的同源重组效率较高)的染色体上，从而同时实现了d-柠檬烯和l-柠檬烯的合成，这是第一次在解脂耶氏酵母中证实了植物源l-柠檬烯合酶的功能。紧接着，利用强启动子hp4d分别对Po1g KU70Δ菌株MVA途径中的ACOAAT1、ACOAAT2基因(编码乙酰-CoA C-乙酰基转移酶)、HMGS基因(编码羟甲基戊二酰辅酶A合酶)、HMG1基因(编码羟甲基戊二酰辅酶A还原酶)、MK基因(编码甲羟戊酸激酶)、PMK基因(编码磷酸甲羟戊酸激酶)、PMVADO基因(编码二磷酸甲戊酸脱羧酶)、IDI基因(编码异戊烯基焦磷酸异构酶)、FPPS基因(编码法尼基焦磷酸合酶)和GGPPS基因(编码香叶基香叶基焦磷酸合酶)进行了单独过表达(图 1)，结果发现在这10个途径基因过表达的工程菌株中，过表达HMG1的菌株产生d/l-柠檬烯的产量为最高，说明HMG1可能是柠檬烯合成路径中最主要的限速酶，这与Cao等[11]的结果是一致的；接着，Pang等首次对柠檬烯产量最高的工程菌株的发酵条件进行了优化，最终确定了最佳温度20 ℃、转速250 r/min、MgSO4·7H2O 0.2%、pH 5.74、培养基体积50 mL、正十二烷添加量10%、初始OD600为2.0的最佳发酵条件；在此最佳发酵条件下，以废弃食用油代替葡萄糖作唯一碳源进行发酵，工程菌株最终成功产生了2.514 mg/L的d-柠檬烯和2.723 mg/L的l-柠檬烯[13]。该项研究的亮点是创新性地实现了将废弃食用油转变成高值产品——柠檬烯，该研究结果也为利用解脂耶氏酵母工程菌株转化废弃食用油生产各种有工业价值的产品奠定了基础。

虽然在解脂耶氏酵母中生产柠檬烯的产量比大肠杆菌中低(大肠杆菌底盘细胞异源合成柠檬烯的最高产量为1.29 g/L[27])，但与大肠杆菌底盘相比，以解脂耶氏酵母作为底盘细胞，未来通过微生物发酵法工业化生产植物萜类化合物的生物安全性更高；同时，解脂耶氏酵母能够将废弃油脂转变成有价值的植物天然产物，从而实现废弃物再利用和“变废为宝”的双重目的，也对创建环境友好型与资源节约型社会的意义重大。

β-胡萝卜素(β-Carotene)是一种橘黄色脂溶性四萜类化合物，与番茄红素、角黄素、虾青素等同属于类胡萝卜素，是自然界中最普遍存在的天然色素之一。β-胡萝卜素不仅具有抗氧化的性质[28]，而且据研究表明β-胡萝卜素也是维生素A的前体物质[29]，因此其逐渐成为一种十分重要的工业化合物并在多种微生物中实现了异源合成。现今解脂耶氏酵母已经被开发作为生产β-胡萝卜素的主要宿主，生成物质主要由全反式β-胡萝卜素和少量其他天然存在的类胡萝卜素组成。

2014年，Grenfell-Lee等为了验证解脂耶氏酵母所生产β-胡萝卜素的毒性作用进行了大鼠口服毒性研究，实验结果证实了解脂耶氏酵母产生的β-胡萝卜素其遗传毒性潜力为亚慢性，是一种安全且可以作为食品成分的化合物[30]。同时，Wang等通过对解脂耶氏酵母全局转录因子进行调控，最终成功获得了β-胡萝卜素“强化”型和“弱化”型的菌株，这也为后续利用解脂耶氏酵母高效生产β-胡萝卜素或者其他类型萜类物质的生产提供了一个新的思路[31]。

2017年，Gao等选取来自海洋生物裂殖壶菌的多功能胡萝卜素合酶基因carS，用于解脂耶氏酵母异源合成β-胡萝卜素的研究(图 1)。该项研究使用了高效DNA组装方法将carS基因的表达盒(GPD启动子-carS开放阅读框-lip2终止子)组装并整合到解脂耶氏酵母的染色体中；同时，通过下调解脂耶氏酵母的非同源末端连接机制(NHEJ)显著提高了目的片段正确重组的效率，通过该方法构建获得的工程菌株最终经过摇瓶发酵产生了0.41 mg/g-DCW的β-胡萝卜素[14]。通过定向进化策略来进一步改善这种多功能胡萝卜素合酶的活性，成功实现了β-胡萝卜素产量的提高[32]。

2018年，Larroude等[15]在解脂耶氏酵母中构建了一个由PGM启动子控制的GGPPS基因、由GAPDH启动子控制的CarB基因(八氢番茄红素脱氢酶)、由TEF1启动子控制的CarRP基因(番茄红素环化酶/八氢番茄红素合酶)这3个基因表达框组成的β-胡萝卜素合成途径，成功实现了β-胡萝卜素的异源微生物合成(图 1)；为了增加前体物质的供应量，又在组成型TEF启动子控制下过表达了截短版本的HMG1基因(tHMG1)，从而有效提高了β-胡萝卜素产量。该研究也探索了启动子强弱变化对β-胡萝卜素产量的影响，研究者使用Golden Gate方法对启动子进行改组并找到了用于高产β-胡萝卜素的最佳启动子集carTEF，即当GGPPS、CarB和CarRP这3个基因均处于TEF1启动子的控制下时，该启动子集可以最大限度地增强目标基因的转录效率，进而增加了各中间产物的产量，终产物β-胡萝卜素的产量也随之增加；然后，研究者又将3个基因表达盒的拷贝数增加了1倍，β-胡萝卜素的产量得以进一步提高；最后，他们设计了一种含有2倍量酵母提取物和蛋白胨的培养基(命名为Y20P40D)，并且以葡萄糖作为补料分批的碳源，在122 h后，工程菌株中β-胡萝卜素的总产量达到了6.5 g/L (90 mg/g-DCW)，这也是迄今为止解脂耶氏酵母异源合成β-胡萝卜素的最高产量[15]。该研究证实了增加途径基因拷贝数以及利用最有利的启动子集来调控多基因的表达量有助于增强目标基因的转录，从而实现了前体物质供应的增加，最终促使解脂耶氏酵母合成β-胡萝卜素产量大大提高。

总之，在利用解脂耶氏酵母生产β-胡萝卜素的研究中，研究者将传统的代谢工程策略与新颖的合成生物学工具在解脂耶氏酵母底盘中进行了结合使用，最终得到的终产物产量明显高于大肠杆菌和酿酒酵母等其他微生物，这使得解脂耶氏酵母成为了截至目前最具竞争力的β-胡萝卜素微生物生产宿主。

桦木酸(Betulinic Acid)又称为白桦脂酸，是一种五环戊烷型三萜，分子式为C30H48O3，其广泛存在于多种植物比如荆条叶子、木瓜果实和桉树叶中，但在白桦树中该物质的含量最多[33]。研究表明，桦木酸具有多种药理活性，例如抗病毒特性(主要是HIV病毒)[34]以及抗癌、抗炎、抗血管生成和免疫调节作用等[35]。因为桦木酸具有诸多药理活性，因此医学应用价值较高，这也吸引着研究者们纷纷尝试利用微生物对其进行合成。

Jin等[16]在2019年将在TEFin启动子控制下的外源基因RcLUS (编码羽扇豆醇合酶)整合到解脂耶氏酵母染色体的Ku70基因座上，实现了羽扇豆醇在解脂耶氏酵母中的首次合成。由于解脂耶氏酵母本身并不存在能够催化羽扇豆醇转化为桦木酸的天然细胞色素P450酶，所以研究者通过筛选不同来源的细胞色素P450氧化酶(CYP)和细胞色素P450还原酶(CPR)进行两两组合，最终选出了来自白桦的CYP编码基因BPLO与来自莲花的CPR编码基因LjCPR或来自紫花苜蓿的CPR编码基因MTR进行组合时可以最有效地生成桦木酸(图 1)；为了进一步提高桦木酸产量，Jin等首先设计了具有结构基因ERG1 (编码角鲨烯单加氧酶)、ERG9 (编码角鲨烯合酶)和HMG1的不同模块组合，并将其整合到解脂耶氏酵母染色体rDNA位点中；然后，再通过直接生成过表达乙酰辅酶A生成途径基因、增强β-氧化途径和促进辅因子再生等手段，进一步提高了目的产物的产量；通过这些代谢工程改造策略的组合使用，三萜类化合物(由65.44%桦木素、23.71%桦木酸和10.85%桦木醛组成)在摇瓶培养下的总产量达到了204.89 mg/L，这也是在微生物中报道过的桦木酸的最高产量[16]。在该项工作中，多模块组合化的系统代谢工程策略的使用有效地解决了由仅操纵内源基因和引入异源基因引起的途径流量不平衡、模块不相容等扰动，从而增加了三萜类化合物桦木酸的产量。虽然与酿酒酵母相比，目前解脂耶氏酵母异源生产桦木酸的最高产量并没有明显优势，但系统代谢工程技术还尚未在解脂耶氏酵母底盘中得到深入应用，预示着解脂耶氏酵母底盘具有较高的桦木酸增产潜力。

番茄红素(Lycopene)属于四萜类的类胡萝卜素，是脂肪族C40分子的重要组成之一。番茄红素可以在许多果蔬中找到，但主要存在番茄或者番茄制品中，并占人体吸收番茄红素总摄入量的80%[36]。近些年，随着人们对膳食营养的关注，人们开始把番茄定义为一种可以减肥的健康食品，因此番茄红素的功效也受到了越来越多的关注。比如2015年番茄红素被认定具有抑制NF-B的活性来阻止乳腺癌、前列腺癌和子宫内膜癌细胞生长的特性[37]，2017年Costa-Rodrigues等证实了番茄红素能给心脏和血管功能等带来益处[38]。因为番茄红素在医疗和健康领域中具有良好的应用前景，所以研究者们越来越重视利用微生物发酵生产该化合物的尝试[39]。

2013年，Matthäus等[17]在解脂耶氏酵母中首次建立了不需要Zeta序列或干扰rRNA编码基因的基因单拷贝整合平台，在这项工作中，研究者首先构建了一个中央带有Not I限制性酶切位点的序列IntB和IntF作为后续的基因单拷贝整合平台，研究结果表明该平台的使用可实现目标基因快速、高效、单拷贝整合到宿主基因组中；利用该平台，在解脂耶氏酵母的TEF1启动子的控制下，实现了番茄红素合成途径多功能基因CarRP和CarB的成功异源表达(图 1)；此后在过表达限速基因HMG1和GGPPS后，菌体生长速度发生下降，但更有利于番茄红素的积累。番茄红素的合成主要发生在解脂耶氏酵母中的脂质体内，所以在该研究中尝试对POX1-POX6基因(编码丙酮酸氧化酶)和GUT2基因(编码线粒体甘油3-磷酸脱氢酶)进行了敲除，最终引起了β-氧化作用和3-磷酸甘油的缺失，结果明显增加了脂质体的形成，进而增加了番茄红素的产量。补料分批培养后，番茄红素的产量达到了16 mg/g-DCW[17]。在该项研究中，新构建的单拷贝整合平台具有可与不同解脂耶氏酵母菌株一起使用但又不改变天然序列的优点；同时，重复使用相同的整合平台进一步提高了转化子稳定性并且减少了工作量、增加了工作效率，值得广泛应用于解脂耶氏酵母基因的染色体整合工作中。

2017年，Schwartz等为了研究最初产生番茄红素的菌株HEBI-LU中存在的URA3 (尿嘧啶)和LEU2 (亮氨酸)营养缺陷对番茄红素产量的影响，通过对URA3和LEU2基因的功能恢复，结果发现番茄红素的产量提升了2倍；为了进一步提高番茄红素的产量，过表达了包括2个拷贝的HMG1、CarB和单个拷贝的CarRP、MK、PMVADO、GGPPS基因，在补料分批发酵10 d后，工程菌株中番茄红素的终产量达到了21.1 mg/g-DCW[18]。该项研究结果有助于让其他研究者注意到营养缺陷型对萜类化合物产量可能带来的影响，为今后生产相关研究提供了新思路。

虽然解脂耶氏酵母合成番茄红素的产量还低于其他宿主如酿酒酵母，但上述这些研究已经为构建生产番茄红素的微生物细胞工厂提供了新的菌种资源，而且通过深入研究影响解脂耶氏酵母底盘中番茄红素合成的关键因素，并在此基础上对番茄红素合成途径进行进一步优化，将有助于番茄红素产量的进一步提高。

芳樟醇(Linalool)又称为沉香醇、伽罗木醇、里那醇等，其分子式为C10H18O，属于链状萜烯醇类，有α和β 2种异构体，一般为铃兰香味。芳樟醇一方面具有清新怡人的香气，另一方面具有抗微生物活性、抗病毒活性、降压、消炎等特性，因此成为药用精油的主要功能成分之一[40]。此外，芳樟醇还因为具有防腐性而被广泛应用在日常家用产品、化妆品等中[41]。目前利用代谢工程及合成生物学技术生产芳樟醇的研究主要集中在酿酒酵母这一常规微生物底盘中，如：2015年Amiri等将薰衣草LIS基因(编码芳樟醇合酶)引入酿酒酵母底盘中成功实现了芳樟醇的异源微生物合成，再通过用MET3启动子代替其天然启动子以下调编码角鲨烯合酶的ERG9基因的表达量，成功提高了芳樟醇的产量(78 μg/L)；然后又过表达了tHMG1基因(截短的HMG1基因)，终产量提高到了95 μg/L[42]；2016年，Deng等则通过构建FPPS和LIS融合蛋白的方式成功将酿酒酵母产芳樟醇产量提高至240.64 μg/L[43]。这些成功的例子也为在解脂耶氏酵母底盘中生产芳樟醇提供了十分有价值的参考。

2017年，Cao等[19]通过将经密码子优化的LIS基因整合到解脂耶氏酵母的基因组中，首次成功实现了芳樟醇在解脂耶氏酵母底盘细胞中的合成(图 1)。为了增加芳樟醇的产量，进一步过表达了HMG1基因和IDI基因。然后又对工程菌株的发酵条件进行了优化，结果发现在以柠檬酸盐为碳源、丙酮酸作为补充碳源时可以产生最大量的芳樟醇；前期研究已证明了对酿酒酵母ERG20基因编码的ERG20p酶(法尼基焦磷酸合酶)进行的修饰而产生的突变体对GPP的亲和力要高于FPP，这样更有利于GPP的合成，进而弱化了GPP到FPP的分流(图 1)，最终严重影响了酿酒酵母中芳樟醇的生产表型[44]。因此，研究者们使用类似的策略对解脂耶氏酵母中的ERG20基因(即FPPS基因)也进行了修饰，命名为ERG20F88W-N119W基因；然后，在解脂耶氏酵母中同时过表达HMG1基因、IDI基因和ERG20F88W-N119W基因，芳樟醇产量达到6.96 mg/L (939 μg/g-DCW)，这是截至目前所报道的微生物异源生产芳樟醇的最高产量[19]。该研究的明显创新性在于首次对解脂耶氏酵母的ERG20基因进行了位点修饰并成功增加了前体物质GPP的供应量，这也是在利用解脂耶氏酵母中合成萜类化合物的所有案例中产量明显高于其他微生物底盘细胞的成功案例，显示出了较好的应用潜力。

法尼烯(Farnesene)又称为金合欢烯，是一种倍半萜类化合物，分子式C15H24，在医药、化妆品、生物能源等多个领域中均有应用价值[45]。例如，法尼烯具有良好的低温特性并且几乎不产生温室效应气体，因此被公认为是喷气机的重要替代燃料[46]。因此大量研究者开始尝试利用微生物对其进行合成。

2019年，Liu等[20]首先通过NHEJ介导的方法将Te质粒线性化并随机整合到解脂耶氏酵母的基因组中，以此构建基因过表达文库并得到了高产FPP的工程菌株；而后又在该工程菌株中导入了经过密码子优化的αFS基因(编码α-法尼烯合酶)，实现了α-法尼烯的合成(图 1)；紧接着，将MVA途径中的MK基因、PMK基因、PMVADO基因、GGPPS基因和FSERG20基因(由ERG20基因与αFS基因融合而成)进行了共过表达，结果α-法尼烯的产量提高了13倍(与仅表达αFS基因的菌株相比)，达到1.70 g/L；最后对工程菌株的发酵条件进行了优化，结果在pH 5.5、空气流量1.5 vvm、搅拌速度500 r/min条件下，α-法尼烯的产量达到了25.55 g/L[20]。在该研究中，NHEJ介导的基因组整合、基因过表达文库的构建、多个途径基因的共同过表达显著增加了中间代谢产物的代谢通量，而构建融合蛋白的方法可在空间上缩短酶与酶、酶与底物之间的距离，增加酶与底物的碰撞几率，从而提高了酶的催化效率，这些可能是导致目标产物高水平合成的关键因素。这也是截至目前在解脂耶氏酵母中报道过的异源萜类化合物合成的最高产量。虽然目前α-法尼烯在解脂耶氏酵母底盘细胞中的产量仍然低于大肠杆菌和酿酒酵母，但是我们认为通过系统代谢工程及合成生物学等技术相结合的理念，深入研究解脂耶氏酵母底盘细胞中α-法尼烯的合成潜力和限制其高产率异源合成的代谢瓶颈，将有助于促进α-法尼烯产量的大幅提高。

由于萜类植物天然产物在众多领域中均具有较高的开发利用价值，这使得其需求量日益增长。解脂耶氏酵母是一种新兴的微生物底盘细胞，同时也是一种产油酵母，体内含有含量比较丰富的乙酰辅酶A[2]。因为乙酰辅酶A正好是解脂耶氏酵母经MVA途径合成GPP、FPP和GGPP等(萜类化合物合成的直接底物)的起始物质(图 1)，因此利用代谢工程技术对解脂耶氏酵母的MVA途径进行改造有望为萜类化合物的合成积累含量更为丰富的直接底物；同时，解脂耶氏酵母能够利用众多廉价疏水性底物进行生长繁殖，这对于降低萜类化合物的生产成本具有重要意义。因此，解脂耶氏酵母成为了异源合成萜类化合物潜在理想的微生物细胞工厂。

虽然目前利用代谢工程技术所构建的解脂耶氏酵母细胞工厂已经实现了多种萜类化合物的生物合成，但是该酵母固有的一些特性也在一定程度上限制了萜类化合物的产量，距离大规模工业化生产还有较大差距。因此，为实现萜类化合物在解脂耶氏酵母底盘细胞中的进一步增产，需要不断地对其中的核心机制和关键技术进行创新性的探索和研究。我们认为有几个问题亟待突破，具体如下：

(1) 解脂耶氏酵母本身并不含有可自主复制的游离质粒，因此在对其进行基因编辑时往往需要首先构建人工合成质粒作为过渡载体，操作烦琐、工作量大。

(2) 非同源末端连接(NHEJ)是解脂耶氏酵母完成DNA双链断裂修复的主要形式，因此该酵母胞内的非同源重组效率极高(与酿酒酵母明显不同)，导致基因定点敲除和敲入都非常困难[2]。近年来的研究发现CRISPR-Cas9介导的基因整合技术将解脂耶氏酵母中同源重组的成功率提高到了50%-70%，显示出良好的应用前景[47]。但是，该技术也仍未完全解决解脂耶氏酵母更倾向于进行非同源重组的问题。

(3) 解脂耶氏酵母是严格需氧的非发酵酵母，只有在氧气充足时才能实现最佳的生长状况，这就可能成为工业发酵生产萜类化合物过程中潜在的制约因素。

(4) 目前提高解脂耶氏酵母合成萜类化合物产量的主要方式仍然局限于通过增强途径关键酶基因的表达量来增加前体物质的供应量。与大肠杆菌和酿酒酵母相比，新的代谢工程策略和合成生物学技术尚未在解脂耶氏酵母中得以广泛应用，这就需要研究者们开发出更多适用于解脂耶氏酵母的创新工具和技术。