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一、材料 1. 缓冲液和溶剂 IPTG 溶液(20%,m/V) X-gal 溶液(2%,m/V ) 2. 培养基 含有适当抗菌素的 LB 或 YT 琼脂板 LB 或 YT 顶层琼脂 3. 专用设备 可调至 45℃ 的恒温块 木制牙签或接种环 4. 载体和菌种 重组质粒转化的 E.coli。 二、方法 1. 将溶化的顶层琼脂分装于 17X100 mm 试管,将试管置于 45℃ 的加热块槽内备用。 90 mm 培养板用 3 ml 顶层琼脂;150 mm 培养板用 7 ml 顶层琼脂。 2. 从加热块取出第一支试管,快速加入活菌含量不多于 3000 ( 90 mm 培养板)或 10000 ( 150 mm 培养板)的细菌悬液 0.1 ml。盖紧试管盖颠倒数次,以使细菌在琼脂中混匀。 3. 打开试管盖,按表所示加入适量 X-gal 和 IPTG ( 如果需要)。盖紧管盖缓慢颠倒数次混匀内容物。 4. 快速将溶化顶层琼脂倾入含有适当抗菌素的凝固琼脂板的中部,旋转培养板使琼脂散匀。 5. 重复步骤 2~3,完成所有样品的铺板。 6. 于室温使琼脂凝固,擦净培养板盖上的冷凝水,颠倒培养板于 37℃ 培养12~16 h。 7. 取出培养板于 4℃ 放置数小时使菌落显色。 8. 鉴定携带重组质粒的克隆。 携带野生型质粒的克隆含有 β-半乳糖苷酶活性,菌落的中央呈淡蓝色,外周呈深蓝色。 携带重组质粒的克隆无 β-半乳糖苷酶活性,菌落呈奶白色或蛋壳蓝,有时会在菌落中央出现假性蓝斑。 以鲜黄色为背景观察琼腊板可增强眼的辨别蓝色和白色菌落的能力。 9. 筛选和培养携带重组质粒的克隆。 软琼脂中蓝色或白色克隆可在不同方向上形成,时常看起来像是遥远而倾斜的星空,不管其方向性,这些克隆很容易用接种环或牙签通过穿剌琼脂浅层而被挑选出来,并转移至含有适当抗菌素的培养基中。
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