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作者：

安培培

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摘要：

威尔姆氏瘤基因1(Wilms tumour gene1, WT1)是第一个被发现与威尔姆氏瘤相关的功能失活的基因,并且在肾脏发育中起着十分重要的作用.WT1基因敲除小鼠无肾脏,生殖腺缺失以及视网膜畸形,因此,在发育过程中,WT1基因与肾脏及生殖腺细胞的存活及分化密切相关.目前对于WT1基因的研究大多数是关于人的各种肿瘤疾病以及小鼠的肾脏及睾丸发育方面的研究,而WT1基因在猪体内表达及功能研究的相关报道较少.猪是我国最重要的肉用家畜,同时在解剖,生理和代谢等方面与人类十分接近,药物代谢,器官大小和功能也基本相似,是人类异种器官移植的重要目标动物和理想的人类疾病模型动物. 因此本实验旨在分离培养原代猪胎儿成纤维细胞(PFF)以及猪肾成纤维细胞(PKF),检测三种猪细胞中PFF,PKF及睾丸细胞(ST)中WT1基因的表达,以及WT1蛋白在这三种细胞中的分布情况,为WT1基因在肾脏和生殖腺中表达及功能的进一步研究奠定基础.主要结果包括:(1)原代培养猪胎儿成纤维细胞(PFF)及猪肾成纤维细胞(PKF);经RT-PCR及荧光定量PCR检测到WT1基因分别在PFF,PKF及ST细胞中表达;细胞免疫荧光染色检测到WT1蛋白在PFF及PKF的胞质中表达,而在ST细胞中的胞质和细胞核中均有表达;(2)成功构建pLV3-WT1shRNA慢病毒表达载体,可有效感染PFF,PKF和ST细胞,感染效率均能达到90%以上,并且均有效下调PFF,PKF和ST细胞中WT1基因及蛋白的表达;(3)经流式细胞仪检测pLV3-WT1shRNA感染PFF,PKF和ST细胞后,细胞均发生早期凋亡,其中ST细胞组的凋亡比率明显高于其他两组;WT1基因表达的下调可导致Bcl-2基因下调,而Bax基因的表达上调;(4)成功构建pIRES2-WT1-EGFP重组质粒;并稳定表达外源WT1-EGFP的ST细胞株;WT1基因表达的上调对ST细胞的生长和增殖并没有观察到明显的影响;(5)RT-PCR检测,Gndf和Sox-9基因在ST细胞中受到WT1基因的正向调控,而在PKF细胞中受到WT1基因的负向调控;Sf-1基因在PKF细胞和ST细胞中其表达呈现下调状态;WT1基因表达的上调对这些发育相关基因的表达并没有观察到明显的调节作用.

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关键词：

WT1基因 猪睾丸细胞 猪胎儿成纤维细胞 猪肾成纤维细胞 细胞凋亡 发育相关基因

被引量：

1