Western Blot经验分享 |
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蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot,是一种常用实验手段,本人对前期经验进行总结,希望对各位科研人员有所帮助和借鉴。 01 相关试剂配置 电泳液:Tris 3.03g 甘氨酸 18.8g SDS 1g 转膜液:Tris 3.03g 甘氨酸 14.4g ddH2O 800ml 甲醇 200ml TBST(10×):Tris 12.1g NaCl 40g ddH2O 500ml 02实验步骤 a. 配胶(以雅酶配胶盒为例) 推荐: 7.5%胶:分子量 30以上; 10%胶:分子量20~150; 12.5%胶:分子量50以下; 取玻璃板,长短各一。检查玻璃板是否干净,可用擦镜纸对玻璃板进行清洁。将两玻璃板贴在一起(注:字在上),插入夹内,用大拇指轻推玻璃板,敲一敲桌面,使玻璃杯底部对齐夹紧玻璃板。将塑料垫放于架子上,放上制胶架上。 (注:第一次操作可用水检测是否漏水,否即可将水倒出,用吸水纸吸干水,进行下一步操作。如出现泄露,需检查,从新调整,保证不漏水的情况下方可进行下一步) 下层胶: AB液:1:1配置(1.0玻璃板两板:5ml:5ml) 促凝剂:100ul 压胶液(异丙醇/无水乙醇):1ml 时间:15分钟以上 (倒出,用去离子水冲洗,滤纸吸干) 上层胶: AB液:1:1配置(1.0玻璃板两板:2ml:2ml) 促凝剂:40ul 灌入后,根据样本数量不同选择不同梳子类型 (推荐15口梳子,内参更易齐哦!!!) 时间:30分钟以上 b. 电泳 将制好的胶板取出,安装于电泳槽上(注:小玻璃板在内侧,如只制作一板胶,则需将假板放于一侧,防止电泳液泄露)。将电泳槽放于电泳盒中,双手分别捏住梳子轻轻拔出,检查胶口是否堵住,否则向电泳槽加电泳液至溢出为止。 根据样本量,吸取3ul marker于胶板口(建议样本两侧都加3ul,防止边缘效应),并依次加入适量上样液(注:上样时需缓慢注入,样本第一次上样推荐10ul,副口,方便后期调整内参)。然后向电泳槽中加入适量电泳液。 电压120V,时间需预实验尝试确定(推荐60min),至marker分出所需位置marker后即可停止。 c. 转膜(湿转为例) 根据实际情况剪取适合大小的PVDF膜(推荐4cm宽,长:15口一口0.5cm,10口一口1cm)。 (注:需剪去一角确定方向) 取适合大小的水槽,倒入适当的转膜液,将转膜夹(黑板—海绵—厚滤纸,厚滤纸—海绵——透明板)浸入转膜液中,随后取出。 将玻璃板在梳子口这侧撬开,切到适合大小。将厚滤纸(黑板侧)盖在胶上,翻转。小心将胶转到厚滤纸上,将厚滤纸放于海绵(黑板侧)上,调整胶块,使marker与厚滤纸底边垂直。随后在胶上确定加样方向,后期将PVDF膜一角在加第一样侧,方便后期显影确定加样顺序。 将PVDF膜浸入甲醇中1min左右,将PVDF膜放于胶上适合位置(用marker条带确定)。剪掉一角边在加第一样侧,盖在胶上,用滚轮排出气泡,盖上另一侧滤纸,海绵,透明板。将转膜板放于转膜槽内,黑板对黑边。 倒入转膜液,放入冰袋。电流200mA,时间需预实验确定(推荐:75分子量以下120min,75分子量以上180min)。 (推荐:后面每步之间均需要TBST清洗,5min,4次) d. 封闭 转膜结束后,将整块PVDF膜放入孵育盒,TBST洗5min,倒入封闭液(根据封闭液不同,条带背景不同,封闭不同时间)。 e. 切膜 将洗好的膜放在塑料薄膜上,盖上塑料薄膜,防止切割时损坏条带。建议两marker间选择做一个目的蛋白,否在可能出现切掉的情况。如果第一次做建议宽一些,使两marker在膜上即可。 (这步TBST洗一次即可) f. 一抗 加入适当的一抗稀释液,4℃过夜/室温2小时,可回收。 (如果蛋白表达高,建议4℃过夜,效果最好) (如果蛋白表达量低,建议室温两小时) g. 二抗 加入适当的二抗稀释液,室温2小时 随后显影即可!!! 03 相关问题解答 a. 背景深? 如果是第一次做,一抗二抗均是新的,内参背景正常,那么就是一抗问题。 解决方法:①4℃封闭过夜 ②换封闭液 ③换一抗 如果是第一次背景正常,突然背景深了,建议一抗,二抗,封闭液同时配新的。 最快解决问题,不要浪费时间!!! b. 条带不出? 说明书建议分子量一般没问题,那么要不就是表达量低,要不就是一抗不行,最不可能的就是二抗错了,那就有点傻了!!! 解决方法:①降低一抗稀释比, 如原1:1000改为1:200 ②提供样本蛋白浓度 ③换一家试剂商的一抗 以上三种都不行,别挣扎了,就是没有,何必呢!!! c. 内参齐? 建议在一块胶板上一个样本做两次。 解决方法:加样顺序如下,每口10ul marker、A、B、C、marker、A、B、C、marker 显影后,算各口灰度值,取各样本所对最大值。 以灰度值最低的样本定为最大上样量10ul。 假设是C样本灰度值是最低,那么A或B加样量=10ul×C灰度值/A或B灰度值 如果有其他问题,可在公共号内发信息,小编尽可能尽快回复您~~ |
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