裂解细胞请尽量冰上操作，减缓酶解作用。

裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl,1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20μg/ml leupeptin,10μg/ml pepstatin A and 10 μg/mlaprotinin)（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制剂可用0.5mMPMSF替代；如果还要做磷酸化蛋白，加1mM Na3VO4（现加现用），10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mMbeta-GP。

此方法的优点：NaCl浓度略低于生理状态，保证裂解细胞的方式较为温和，便于随后的IP等试验。其他Na盐浓度的细胞裂解液也很常见，诸如0.15M（生理盐浓度）、0.3M、0.6M（高盐系列，裂解细胞时染色体会析出，细胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下适合 IP试验，0.6M及以上适合纯化蛋白，尤其相互作用较强的复合体，要得到纯化的一些复合体的组成蛋白一般采用极端的高盐裂解细胞。

组织块较大用匀浆的方法最合适，现在有不少转头很小的匀浆器。

当组织超微量的时候，比如50mg新鲜癌组织， 建议采用的方法是

1. 低温（剪）搅碎，成肉糜状。

2. 锡箔纸包裹好，放入少量液氮，快速敲击（控制力量，尽量避免弄破锡箔纸），进一步破碎；反复多次。

3. 用上述细胞裂解液回收。

组织块较大用匀浆的方法最合适，现在有不少转头很小的匀浆器。

当组织超微量的时候，比如50mg新鲜癌组织， 建议采用的方法是

1. 低温（剪）搅碎，成肉糜状。

2. 锡箔纸包裹好，放入少量液氮，快速敲击（控制力量，尽量避免弄破锡箔纸），进一步破碎；反复多次。

3. 用上述细胞裂解液回收。

用无血清培养基培养细胞，收集上清液用于WB检测；如果含量过低，需要用TCA沉淀富集。

采用无血清培养基收集细胞上清除了改变细胞的生理状态外（可能激活未知信号途径，诸如AKT等）， 还会出现的问题是：

1. 即使采用了无血清收集上清，仍然有大量杂蛋白，但相对好很多。

2. 选用了上清，由于蛋白浓度太稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。

a. TCA沉淀对半定量操作要求非常高，因为很容易沉淀不充分或者离心操作丢失，尤其在离心过程，离心管的摆放非常讲究，要180度翻转离心两次。

b。重新溶解时，由于蛋白需要在一定的盐离子条件下才能重新溶解，你要摸索充分溶解的条件，相对麻烦。

实际上，如果你不是非常强调蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建议检测上清，尤其半定量的WB实验检测不同样品间的差异。

用无血清培养基培养细胞，收集上清液用于WB检测；如果含量过低，需要用TCA沉淀富集。

采用无血清培养基收集细胞上清除了改变细胞的生理状态外（可能激活未知信号途径，诸如AKT等）， 还会出现的问题是：

1. 即使采用了无血清收集上清，仍然有大量杂蛋白，但相对好很多。

2. 选用了上清，由于蛋白浓度太稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。

a. TCA沉淀对半定量操作要求非常高，因为很容易沉淀不充分或者离心操作丢失，尤其在离心过程，离心管的摆放非常讲究，要180度翻转离心两次。

b。重新溶解时，由于蛋白需要在一定的盐离子条件下才能重新溶解，你要摸索充分溶解的条件，相对麻烦。

实际上，如果你不是非常强调蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建议检测上清，尤其半定量的WB实验检测不同样品间的差异。

注意事项

样品制备完，应立即 低温保存【-20度短期（几天）； -80度长期；例如，IP用样品应直接进行IP，避免冻融破坏蛋白质间弱的相互作用】。SDS LB煮沸过的样品冻融会存在另一个问题，SDS沉淀；SDS在4度就会沉淀，何况-80度。上样前应加热充分溶解，否则从加样口向下拖带（SDS LB不够，样品未充分溶解也会出现类似拖尾；上样过大也会）。

在样品制备过程中， 另一个需要注意的问题是， 从样品制备的起始阶段就要注意定量问题；WB本身系统误差有20%，太细微的差别经常忽略不计。细胞样品可以先计数再接种，短时间内即使细胞生长有差异也不会对WB结果影响太多。组织样品，从肿瘤组织的大小（称重）开始，裂解液的体积都是精确定量的，操作过程也 尽量避免蛋白损失。 返回搜狐，查看更多