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蛋白质的提取与检测

第一节

细胞总蛋白的提取及含量测定

【基本原理】

蛋白质含量测定法是生物化学研究中最常用、

最基本的分析方法之一。

目前

常用的有四

种经典的方法，即定氮法、双缩脲法（

Biuret 

法）、

Folin- 

酚试剂法

（

Lowry 

法）和紫外

吸收法。另外还有两种近年普遍使用起来的测定法，即考马

斯亮蓝法（

Bradford 

法）与二辛

可宁酸法（

BCA 

法）。值得注意的是，上述方法

并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白

质，

因为一种蛋白质溶液用这几种方

法测定有可能得出不同的结果。每种测定法都不是完美无

缺的，都有其优缺点。

在选择方法时应考虑：

①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；

②蛋白

质的性质；

③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。

Lowry 

法：蛋白质与碱性铜溶液中的二价铜离子络和使得肽键伸展，

从而使

暴露出的酪

氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与

磷钼钨酸

反应并产生深蓝色，在

750nm

有最大光吸收值。在

一定浓度范围内，反应液颜色的深浅与蛋白质中的酪

氨酸和色氨酸的含量成正比

,

由于各种蛋白

质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相

同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。

Bradford 

法：蛋白质与染料考马斯亮蓝

G-250 

结合，

使得染料最大吸收峰从

465nm

变为

595nm

,

溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。

在一定的线性范围内，反应

液

595nm

处吸光度

的变化量与反应蛋白量成正比，测定

595nm

处吸光度的增加

即可进行蛋白定量。

BCA 

（

Bicinchoninic acid 

）法：二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质

还原成一

价铜离子（

Biuret reaction

）并与

BCA

相互作用产生敏感的颜色反应。

两分子的

BCA 

螯合

一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在

562nm 

处显示强烈的吸光性，吸光

度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关

系，根据吸光值可以推算出蛋白浓度。

试剂配制】

1. 

1.74mg/ml 

(

10mmol/L

) 

PMSF

: 

0.174g PMSF

溶解于

100ml 

异丙醇，分装于

1.5ml

离心管中，

-20

C

保存。

2. 

细胞裂解液

: 

50mM Tris-HCl 

(

pH 7.4

)

，

150mM NaCl

，

1mM PMSF

，

1mM