STEP2:

将电极放入电泳槽中

红对红黑对黑。干说不行，上图：

STEP3:

倒入电泳液

倒入电泳液，玻璃板中间的，倒满，电泳槽中倒到白色腿腿上面，这也是我为什么胶板要夹紧的原因，霸气的小伙伴可以选择直接倒满，就可忽视这一步。（上极液可回收下次做下极液，下极液就不回收了，不过现在我都不回收，因为我这样总共也用不了多少）跑2板胶450ml就够了，跑4板700ml就够了。

注意：玻璃板底部不要有气泡，尤其是玻璃板中间胶下方那个空隙，如果有气泡会阻断那块的电流，你可能会发现有几个泳道没动，跑出一座山峰。

STEP4:

拔梳子，加样

①拔梳子时要垂直拔！垂直拔！这样泳道不会歪。

②加样时如果没有加样枪头就用10μl的，这个枪头尖可以伸进去一点，缓慢打入样品，二档打完大拇指头不要动，摁住，先抬枪，等枪离开页面再抬起你的大拇指头，防止样品反吸。

③加样时注意，样品不把边，也就是说最边上两道不加样品，因为有边缘效应，样品会歪，比如，我十孔的胶，我有八个样，我会中间八个泳道加样品，左右两道加marker，一边多一边少，第一为了区分正反，第二，因为我一板胶不止跑一个指标，两边把着切胶时防止切歪。而且如果有空的泳道用1×loading buffer补齐。

STEP5:

红对红黑对黑贯彻到底，盖上盖连接电泳仪

设置电压，我一般80V跑浓缩胶，100V跑分离胶。我个人喜欢80V多跑一会，那样条带会压的更细更漂亮，而且跑的比较开，这样比较好多跑几个指标。

STEP6:

开始制冰，配好转膜液

电泳要跑近两个小时，不要闲着我的朋友！开始制冰，配好转膜液，可以先放在-20℃，转膜液一般可以回收使用2·~3次，用过两三次的转膜液我会拿来泡膜，准备好转印的夹子和海绵、滤纸板、滤纸放在一个容器中（我一般用器械盘，刚刚好），倒入泡膜液，开始擀气泡，先在小黑上放上海绵，然后放上滤纸板或者5~6层滤纸（如果用5~6层滤纸，请一层一层擀气泡），然后再盖上一层滤纸，继续擀气泡，然后就可以wait电泳跑完了。

STEP7:

电泳等最下面的指示剂跑到分离胶的下三分之一处就可以啦

当然，想往下跑跑也行，只要别跑出去就好。将玻璃板卸下来，可以用梳子量一下胶上你所需的膜的大小，个人不建议整个一个胶贴一大张膜，虽然很豪气，但是又浪费又容易气泡擀不干净还容易背景高。我的切胶方式以下图为例：

以10%的分离胶为例，我一般30kd以上的蛋白用0.45um的PVDF膜，以下用0.22um的膜，30kd~70kd恒压70V转1.5h（二十多用0.22的膜也可用这个条件，十几的话不建议用10%的胶了），70-140kd的100V转1.5h，140-180kd 100V转2h。前提是我的转膜液配方，用去离子水配。

STEP8:

PVDF膜

剪出所需大小的PVDF膜（一定不要用手碰，沾了油脂最后发光会黑乎乎一片），可以在膜的一角写字，这种笔就ok

然后将PVDF膜放入甲醇中激活使膜带正电（这个甲醇可以回收，我一般50ml可以重复用很久），30s就ok了，然后将膜放入泡膜液里平衡。

STEP9:

擀气泡

用翘板撬开玻璃板，切掉多余的部分，将所需的胶放在擀好气泡的小黑上面的滤纸上面，擀气泡！将胶摆直，挪胶时把翘板在泡膜液里泡一泡，这样挪胶比较顺滑。将对应的PVDF膜贴在胶上面，擀气泡！盖上一层沾湿的滤纸，足够湿的话从一个角开始慢慢盖就没有气泡，有的话轻轻擀一下，然后盖上沾湿的滤纸板（或一层一层叠5~6层滤纸），手指摁住擀一擀，千万别擀歪了。盖上海绵，盖上小白，把夹子夹住。

（擀气泡用小孩滚橡皮泥那个小滚滚就行）

STEP10:

将夹子放入转印电极中，小黑对黑，小白对红！

一个电极可以放两个夹子。

然后放入电泳槽中：继续坚持红对红黑对黑，再在图中的位置放一个小冰盒。

放入大泡沫箱或者盆里，周围放上冰，再倒点水。在电泳槽中倒入转印液，盖上盖。红队红黑对黑再次检查，插上电泳仪，设好电压及时间，开始！注意观察电流变化，电流过大会发热，我一般电流不超过300mA，电流过大会发热，胶可能会变形，最后可能发现条带是小波浪。

STEP11:

电泳结束后将膜放在TBST里洗1~3min

STEP12:

倒入封闭液

倒入封闭液，摇床最慢的速度摇，注意膜不要粘在一起。封闭液一定要检查有没有小颗粒，要完全溶解，混匀。封闭时间开头已经提过了，30min~2h。

STEP13:

TBST洗1~3min

TBST洗1~3min，如果封闭液与抗缓一致，可以不洗

STEP14:

加一抗

加一抗，有抗体孵育盒，但是比较费抗体，我一般用塑封机做小指套，就是把PE手套的手指头剪下来，先压1、2，将膜装进去后压3，加进去一抗后赶气泡，将气泡赶走后，压4.

然后将小指套贴在一个平的东西上（比如：六孔板盖、平皿盖，我喜欢攒六孔板盖，一个盖可以放两个小指套，还可以摞起来）。

有可以放摇床的4℃冰箱的话就放进去平衡木摇床进去摇，没有的话就放平就行。

4℃过夜。

STEP15:

第二天取出小指套

第二天取出小指套，（一抗可以回收）膜TBST里洗5min×3，如果背景过高可以洗10min×3或者3min×5。

STEP16:

加二抗

方法同前。注意的是，如果一抗是鼠来源的，二抗就用抗鼠的，如果一抗是兔来源的，二抗就用抗兔的。室温孵育1h~2h，平衡木摇床摇。

STEP17:

TBST洗5min×3

TBST洗5min×3，如果背景过高可以洗10min×3或者3min×5。

STEP18:

发光

发光！滴加发光液的时候注意不要有气泡哦！滴加均匀！但不要过多。

好了，整个实验过程就是这样了。

有很多小细节，很多人都没有注意到，希望大家做western时能够稳如泰山，宁肯慢也不能漏掉每一个小细节！

END

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