图2. 细胞结构及裂解液选择推荐

（二）蛋白定量

准确测定蛋白样本浓度，既能标准化电泳时蛋白上样量，又能更好的配合内参靶标对目的蛋白进行定量分析。

表1. 常见的蛋白定量方法比较

（三）蛋白电泳

图3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理示意图

选择合适的蛋白胶，能够更好的对目的蛋白进行分离及检测。 原则：高浓度的蛋白胶适合分离小分子量的蛋白；低浓度的蛋白胶适合分离高分子量蛋白；梯度浓度胶可以兼容多种浓度的分离效果。

图4. 蛋白胶浓度分离蛋白分子的范围

蛋白胶类型选择，既可节省蛋白电泳时间，又可对电泳效率进行提高。

表2. 不同蛋白胶组分组成及差异

（四）蛋白转膜

转膜即将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）。蛋白转膜方法可大致分为湿转和半干转两种类型。用于Western blot的膜也有不同的类型及差异：

转印小技巧：

由于SDS能够阻止蛋白与膜的结合，因此小分子蛋白转膜可不加SDS，同时甲醇浓度提高到20%；大蛋白易在凝胶里形成沉淀，转膜缓冲液中加入0.1%SDS，可增加蛋白的溶解性；由于甲醇易使SDS从蛋白上脱离，可降低甲醇的浓度（低至10%或者更低）来防止蛋白沉淀。

（五）膜封闭

封闭剂种类：脱脂奶粉（36120ES）、BSA（36101ES）、动物血清等，某些品牌特定的封闭剂等。

封闭剂使用注意事项：

1、做免疫组化和免疫荧光实验建议用血清封闭；

2、某些抗体使用BSA封闭可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，具体需阅读说明书 ；

3、以下情况不用脱脂奶粉：

生物素化标记的抗体；磷酸化抗体检测蛋白磷酸化；碱性磷酸酶（AP）显色方法

4、封闭时间：一般封闭1-2 h即可；后续可根据实验结果的背景强度来延长时间或更改封闭液种类。

（六）抗体孵育

蛋白抗体选择时的原则：

核实靶标基因；

核实靶标基因；

明确实验类型（WB\ELISA\IHC等）；

明确实验类型（WB\ELISA\IHC等）；

分析样本来源。

分析样本来源。

抗体根据标记靶标方式的不同，分为直标和间标法两种，具体差异如下图：

图6. 直标抗体与间标抗体比较

（七）结果成像

常用的WB显色方法有两种，一种是DAB显色法（36201ES-36203ES）；另一种是ECL显色法（36208ES）。

图7. WB成像原理及结果

DAB即二胺基联苯胺，是过氧化物酶(如HRP)的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色的变化和积累，形成浅棕色不溶物。

ECL( Enhanced Chemiluminescence)原理是鲁米诺被HRP和H 2O 2氧化，产生荧光，这个过程被发光增强剂加强，具有稳定性好，灵敏度高、背景低等特点。

推荐神器：膜再生洗液36215ES

全 膜再生液可有效去除PVDF或者NC膜上结合的一、二抗，同时温和作用维持蛋白的完整性不受影响。再次在同一张膜上进行孵育另一靶标的一、二抗，实现表达量检测以及最大可能的降低重新上样引起的误差。

原则：优先检测表达量较低的目的蛋白，用再生液处理后检测表达量高的蛋白。

图8. 膜再生使用示意图

（八）结果分析

对于处理过或者是不同组织蛋白表达量的会涉及到量的变化，如何对这个表达量进行分析呢？此时借助不同软件，通过对Western blot的结果条带的灰度值计算，来做统计分析。比如比较简单的软件Image J可实现该功能：

图9. Image J软件使用截图（图片来源网络）

Image J软件，根据靶标蛋白以及内参蛋白的条带灰度，实现靶标蛋白的表达量分析。灰度的概念是使用黑色调表示物体，即用黑色为基准色，不同的饱和度的黑色来显示图像。采用ECL发光时，蛋白条带发出的荧光会曝光在胶片上，留下的黑色条带。

二、WB实验应用场景

定性分析：从总蛋白质中检测目标蛋白有无；

定量分析：以标准品为对照，定量确定组织或细胞中目的蛋白的表达情况；

实验研究：不同蛋白之间的相互关系、蛋白与核酸之间的相互关系；

应用互补：常配合ELISA来进一步分析蛋白功能（图10左）、免疫荧光IF对靶蛋白定位分析（图10右），以及配合流式FACs和组化IHC等技术共同研究。

图10. ELISA及免疫荧光IF实验结果图（图片来源于网络）

三、蛋白免疫系列产品部分高分文章

[2] L, Li H, Su X, et al. Chlorzoxazone, a small molecule drug, augments immunosuppressive capacity of mesenchymal stem cells via modulation of FOXO3 phosphorylation. Cell Death Dis. 2020;11(3):158. Published 2020 Mar 2. 磷酸酶抑制剂混合物 20109ES

[3] Yu D, Han GH, Zhao X, et al. MicroRNA-129-5p suppresses nasopharyngeal carcinoma lymph angiogenesis and lymph node metastasis by targeting ZIC2. Cell Oncol (Dordr). 2020;43(2):249-261. BCA蛋白定量 20201ES

[4] Xu P, Zou M, Wang S, et al. Construction and characterization of a truncated tissue factor‑coagulation‑based composite system for selective thrombosis in tumor blood vessels[J]. International journal of oncology, 2019, 55(4): 823-832. 三色蛋白marker 20351ES

（ 本文转自翌圣生物）

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