Western Blot 常见问题解答

1. Q: SDS-PAGE原理?

   A: SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

2. Q: DTT和巯基乙醇的作用及区别？

A1: 作用：都是巯基类还原剂，可以保护蛋白质上自由的巯基不被氧化，从而避免蛋白质的聚集或变性。实验使用过程中，加入DTT或者巯基乙醇，以打开蛋白间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构，防止蛋白形成分子间或分子内的二硫键。β-巯基乙醇常用浓度为5-20mM，DTT为0.5-1mM。

A2: 区别：beta-巯基乙醇是上述三种还原剂中还原能力最差的一个，效果一般只能维持2－3天。DTT有两个巯基基团，其作用能维持3－7天。

碱性条件下，beta-巯基乙醇效果要好于DTT。

DTT可以使Ni被还原，因此在用Ni柱纯化His标签的蛋白时要避免使用DTT，而应该考虑beta-巯基乙醇。

DTT的刺激性气味要小很多，毒性也比巯基乙醇低很多，由于容易被空气氧化，因此DTT的稳定性较差。

3. Q: 蛋白浓度测定试剂盒的区别？

A: Lowry法（灵敏度低）：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。此外，不同蛋白质因酪氨酸、色氨酸含量不同而使显色强度稍有不同。影响因素：氨基酸、NH4+，兼性离子缓冲液、非离子表面活性剂、蔗糖、含硫化合物、PEG化的蛋白（可用BCA法）、酚类、柠檬酸和巯基化合物、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油。。。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

BCA法（灵敏度高）：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫蓝色的络合物。常用浓度的去垢剂SDS，Triton X-100，Tween不影响检测结果。实验中，若发现样品稀释液或裂解液本身背景值较高，可试用Bradford蛋白浓度测定试剂盒。影响因素：蔗糖、NH4+、尿素、螯合剂(EDTA, EGTA)、还原剂（DTT，巯基乙醇）和脂类....

货号

名称

组成

说明

PC0010

Bradford蛋白浓度测定试剂盒

5×G250染色液

100ml

2-8℃

干扰物质少， Tris、糖、甘油、巯基乙醇、氨、EDTA等均不干扰测定。

BSA(5 mg/ml)

1ml

-20ºC

PBS稀释液

30ml

2-8℃

PC0020

BCA蛋白浓度测定试剂盒

BCA Reagent                   

100ml

2-8℃

BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。

Cu Reagent

3.0ml

2-8℃

BSA(5 mg/ml)

1ml

-20ºC

PBS稀释液

30ml

2-8℃

PC0030

Lowry法蛋白浓度测定试剂盒

Folin酚甲试剂A

200ml

2-8℃

Lowry法测定较为不受脂类物质干扰，适于脂类含量较高的样品测定。也能耐受相当浓度的去垢剂如SDS。

Folin酚甲试剂B                                 

5ml

2-8℃

Folin酚乙试剂

20ml

2-8℃

BSA(5 mg/ml)

1ml

-20ºC

PBS稀释液

30ml

2-8℃

Bradford法（灵敏度高）：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液呈红棕色，与蛋白质结合后呈蓝色，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。不受绝大部分样品中的化学物质的影响，样品中巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5mM，但受去垢剂影响，需确保SDS的浓度低于0.1%，Triton X-100低于0.1%，Tween 20, 60, 80低于0.06%。含去垢剂的样品推荐使用索莱宝生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒。影响因素：甘油、乙酸、去污剂、triton x-100、SDS、碱性缓冲系统。。。于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。

4. Q: PC0020的500孔（50T）是什么意思？

A: 酶标仪可以检测500个孔，换用分光光度计的话，可以检测50个。

5. Q: T8090是什么？

A: 作用相当于TEMED，可促进PAGE凝固。

6. Q: 变性胶和非变性胶的区别（自制的）？

A: 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是根蛋白质或多肽与SDS结合，经热变性和二硫键的还原，形成所带负电荷相对一致的非折叠衍生物，其泳动速度主要由分子量决定。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)里面没加变性剂（SDS、巯基乙醇、DTT），可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。

一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。 酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会向阳极移动;而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离碱性蛋白。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的注意事项：蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关，还和蛋白质的分子量以及分子形状有关，其中蛋白质的等电点是最重要的影响因子，要根据蛋白质的等电点来选择对应的电泳缓冲系统;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，要注意电压过高引起发热而导致蛋白质变性，所以最好在电泳槽外面放置冰块以降低温度;蛋白质的分子量较大，则电泳时间可以适当延长，以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开，反之亦然;变性样品的离子强度不能太高(I