上期主要介绍了WB和SDS-PAGE实验的原理和流程，本期将详细介绍SDS-PAGE实验的操作及注意事项。

实验步骤

一、实验所需溶液

1、30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29.2g，亚甲基双丙稀酰胺0.8g，加入双蒸水定容至100mL， pH值不能超过7.0，容器外包锡纸，4℃冰箱保存。

2、分离胶缓冲液：1.5mol/L Tris-HCI，pH8.8：9.09g Tirs碱，溶于30mL双蒸水中，加入浓盐酸调节pH值至8.8，定容至50mL。

3、浓缩胶缓冲液：1.0mol/L Tris-HCI，pH6.8：6.05g Tirs碱，溶于30mL双蒸水中，加入浓盐酸调节pH值至6.8，定容至50mL。

4、10%SDS：2g SDS溶于双蒸水中，定容至20mL，加热至68℃助溶。

5、10%过硫酸铵：0.5g过硫酸铵，溶于5mL双蒸水中；现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。

6、TEMED（四甲基乙二胺）：原液，低温保存。

7、电极缓冲液（pH8.3）：SDS 1g，Tris 3g，Gly 14.4g，加双蒸水溶解并定容到1000mL。4℃冰箱保存。

8、上样缓冲液：5mol/L Tris-HCl pH6.8 1.25mL，甘油2mL，10%SDS 2mL，B-巯基乙醇1mL，0.1%溴酚蓝0.5mL，加双蒸水定溶至10mL。

9、考马斯亮蓝R-250染色液：1g考马斯亮蓝R-250、250mL异丙醇、100mL冰醋酸加双蒸水搅拌均匀并定容至1000mL，用滤纸除去颗粒物质，室温保存。

10、脱色液：100mL冰醋酸、50mL乙醇，加双蒸水搅拌均匀并定容至1000mL。

注意事项

1、30%丙烯酰胺配制好后建议一个月内用完。

2、过硫酸铵建议现配现用。

3、丙烯酰胺具有很强的神经毒性且可以通过皮肤吸收，配制30%丙烯酰胺时应戴好手套和口罩。

二、玻璃板的组装

1、清洗玻璃板，洗净后晾干。

2、玻璃板对齐后放入夹中卡进，然后垂直卡在架子上。

注意事项

1、SDS-PAGE凝胶的厚度通常为1.0mm和1.5mm，WB实验使用1.0mm厚度的凝胶转印效果较好。

2、实验前可通过向组装好的玻璃板中加入双蒸水检查是否漏水，如组装无误但发生了漏水现象，可能是玻璃板或胶条密封性出现了问题，也有可能是架子松动无法卡紧，需及时更换器材，以免实验中出现漏胶现象。

三、分离胶和浓缩胶的配制

1、选择合适的离心管作为容器，以10%分离胶和5%的浓缩胶为例，按表1提供的参数配制，配制好后轻轻摇晃离心管使试剂混匀。

1、灌胶及上样

（1）使用移液枪吸取适量分离胶溶液缓慢放出，使其沿玻璃板留下避免产生气泡，待胶面升至玻璃板约2/3的位置即可，加入适量乙醇进行液封，待分离胶凝固后倒去乙醇并使用吸水纸将乙醇吸干。

（2）灌注浓缩胶方法与灌注分离胶相同，注意避免产生气泡。将玻璃板剩余空间灌满浓缩胶后垂直插入梳子。待浓缩胶凝固后，将梳子垂直拔出。

（3）检测蛋白浓度，计算上样量。加入足够电泳液后（至少漫过内侧的小玻璃板）将上样样品与上样缓冲液按体积比4:1混合煮沸5min，缓慢加入加样孔，避免样品溢出加样孔。

注意事项

1、分离胶处于下层，需要先配制分离胶，待其凝固后配制浓缩胶，凝固时间一般在20-30min。溶液配制好后轻轻摇晃，勿用枪吹打，否则会造成条带模糊。

2、加样前，可用吸水纸洗去加样孔中的气泡。Marker和样品尽量不要加在最边上的加样孔中，加在边上时，跑出的条带可能是斜的。

四、电泳

加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电压控制在100~200V，大约15~20min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电压升到200V，电泳过程保持电压稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1~2cm处即停止电泳，约0.5-1h。如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。

注意事项

1、跑电泳时可留意下电流大小，若电压很高，电流很低（5mA以下），说明电泳槽没有正确装配，电流未形成通路，需重新装配电泳槽。

五、染色及脱色

电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.2%的考马斯亮蓝染液，染色2~4h，必要时可过夜。

弃去染色液，用双蒸水将胶面漂洗几次，然后加入脱色液进行扩散脱色，至蛋白质带清晰。

注意事项

1、若需要长时间脱色，需要更换脱色液且量要足够，否则甲醇会发很快，胶容易干卷。建议不要脱太久，否则弱带就看不见了，胶也会变得失真。

条带的异常现象及解决方法

Q1：出现“微笑条带”（两边翘起中间凹下）。

A1：多出现于较厚的凝胶中，主要是因为凝胶的中间部分凝固不均匀。待凝胶充分凝固后再做后续实验可避免该现象。

Q2：出现“皱眉条带”（两边向下中间鼓起）。

A2：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未清除干净。可在两板间加入适量缓冲液，以清除气泡。

Q3：出现拖尾现象。

A3：主要是样品溶解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。可在上样前瞬离混匀或降低分离胶浓度。

Q4：溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质还未跑下来。

A4：可能是上样缓冲液配制不正确或者分离胶浓度过高。配制缓冲液时注意pH值或降低分离胶浓度。

Q5：条带很粗。

A5：可能是样品未浓缩好。需适当增加浓缩胶的长度或者适当降低电压。

本期主要介绍了SDS-PAGE实验的操作步骤、每步操作需要注意的重点以及电泳条带的常见问题。下期将详细介绍WB的相关内容，感兴趣的小伙伴可以留意一下哦~

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