WB，(Western blotting),中文名蛋白质印迹，又称免疫印迹(immunoblotting)，用于检测特异性目的基因表达的蛋白成分。比如说你要用大肠或者酵母表达某种目的蛋白，把基因克隆到宿主后，要检测的目的蛋白的表达就可以用western blot。

总体来说有5个步骤，蛋白电泳，转膜，封闭，加抗体，以及检测。

在电场的作用下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测，经常用于目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的互作。

WB的一般流程：

01

蛋白的提取                                                         

好的蛋白是WB成功的一半

详细蛋白提取方法请参考：《科研干货｜最常见的6种蛋白提取方法，你都学会了么？》

经验总结：

1：合适的盐浓度下，保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。

2：尽量除去核酸，多糖，脂类等干扰分子

3：提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶抑制剂）。

1.4：蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存，不要反复冻融。

5：蛋白浓度低时，可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。

02

电泳                                                                     

详细电泳原理介绍请参考：《WB做了那么久 看了这篇终于把蛋白电泳的原理搞懂了！》

凝胶浓度与蛋白分离范围

经验总结：

1：上样时：根据蛋白表达丰度调整蛋白上样量，尽量保证每孔上样量保持一致。

2：胶最好现配现用，如果需要保存，最好用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中。

3：为了检测整个实验系统或校准实验结果，需要设置内参（一般指由管家基因编码表达的蛋白）。

4：为了确保western blot结果的准确性和特异性，设置合适正确的对照是必不可少，一般需要设置的对照如下——

阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率；

阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性；

二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性；

内参对照：检测标本的质量和二抗系统

空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果。

03

转膜（Western blot成败的关键）                          

用于western blot的杂交膜主要有两种：NC膜和PVDF膜，可依据目的蛋白与膜的结合能力及膜的孔径来挑选不同的转移膜。

两个膜之间的比较：

 聚偏二氟乙烯（PVDF）

PVDF 膜具有很强的蛋白结合能力（约为硝化纤维素的两倍），并且在通常的处理中不易破裂，因此可以用于抗体的剥离和重孵育实验。低荧光背景的PVDF膜结合了PVDF的优势，并且在很宽的波长范围内具有低自发荧光。在长时间曝光情况下，不会增加背景荧光水平，有利于检测微弱的荧光信号，是WB最常用的转印膜。

PVDF膜通常有0.45 μm和0.2 μm 两种孔径可供选择：

大多数免疫印迹实验，可使用0.45 μm孔径为 的膜；

而转印低分子量蛋白 (50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

详细转膜原理介绍请参考：《看了这篇才知道 原来WB转膜竟然有这么知识点和技巧！》

04

免疫印迹                                                                 

经验总结：

1：常见的封闭液有5%脱脂奶粉、BSA和Western Blot膜封闭液（生物试剂公司提供）。但是封闭液的选取具体得看抗体说明书，有的抗体是明确要求只能用BSA，而封闭液浓度的选择也是具体得看抗体的要求，但是一般情况5%BSA会比5%牛奶的效果好。

2：选择抗体时，一方面需要考虑所选抗体是否能识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一方面需要考虑所选抗体是否会引起交叉反应条带。

05

底物显色                                                              

WB最常选用ECL发光液发光。ECL发光液分为A液和B液，按照1:1的条件混合配制。洗膜结束后，倒出多余的TBST，但是也要在洗膜的塑料盘中留有一些，防止PVDF膜干掉。基本上1ml的工作液可以覆盖10cm3，发光的效果与发光液的新鲜程度有关，所以要现用现配。

ECL的发光原理是：发光剂中的鲁米诺被过氧化氢和HRP氧化，产生荧光，整个发光过程被增强剂增强了发光效果，可以将灵敏度提高到1000-100000倍，但是也会遇到猝灭的情况，除了成像机器老化的原因外，也与发光液的新鲜程度和一抗二抗的浓度有关。

质量好的发光液配合着合适的一抗二抗浓度，才能快速完美的发光。小于1分钟的发光时间固然是我们所向往的，但是碰上信号低的蛋白，我们也要想尽办法让它们显示出结果。对于信号弱的蛋白条带，我们可以手动调整发光时间少一些，比如说10sec，快速曝光比延长曝光时间的显影效果更好。

条带分析问题请参考：《微笑的条带 哑铃条带 WB各种“奇葩”条带的成因竟是这个（附解决办法）》

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实验所需试剂

货号试剂名称-(GBCBIO)G3424高效RIPA组织/细胞裂解液（强）

S213蛋白酶抑制剂(动物）|Protease Inhibitor Cocktail 

S216磷酸酶抑制剂|Phosphatase Inhibitor Cocktail（100X）

G3522BCA蛋白浓度测定试剂盒|BCA Protein Assay Kit 

G555030%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(29:1)|30%Acrylamide

G34071M Tris-HCl,pH6.8

G34191.5M Tris-HCl,pH8.8

04861过硫酸铵APS|Ammonium persulfate

07611四甲基乙二胺|TEMED

G3422SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)|SDS-PAGE Loading Buffer

G4037Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液 PH 8.3|Tris-Glycine SDS

G4038Tris-Glycine Buffer电转缓冲液|Transfer Buffer

PPL4Prestained protein ladder (10-180 KD) 彩虹预染蛋白Marker 10-180KD

G0993 10X Western转膜液|Transfer Buffer

G7205 Western 10分钟快速封闭液 FastBlockTM Blocking Buffer

G3658 Western通用抗体稀释液 Antibody Dilution Buffer

0332牛血清白蛋白BSA|Albumin, Bovine, Fraction V, Heat Shock Isolation

G3308 超敏ECL发光液|SuperEnhanced ECL

品牌优势

GBCBIO--自主品牌--物美价廉--服务优质

 广州捷倍斯生物科技有限公司(GBCBIO Technologies)专注于生物试剂与诊断原料的研发、生产与销售，致力于提高国产生物试剂的竞争力。自主品牌----GBCBIO®牌核酸纯化试剂盒、ECL发光液、蛋白定量试剂盒与高端的表面活性剂等已为广大的科研与工业用户所使用，产品达到同类进口品牌的品质，具有物美价廉的特点！

      捷倍斯生物可以提供专业和完善的核酸分离纯化解决方案，有硅胶柱法、磁珠法与溶液直接法的核酸纯化产品，在二代测序的样品前处理方面有着专业的技术与积累，有完善的针对唾液、血液与血浆等样品的保存、运输与高通量核酸纯化等整套的解决方案。    在诊断试剂原料方面，捷倍斯生物可以提供生物染色剂、高端的表面活性剂、显色底物、生物缓冲剂以及酶制剂与其稳定剂等系列产品。

     视质量如生命的我们，以“做值得交往的人，做值得信赖的产品”为信念，期望通过我们努力的能够为您提供优质的产品与贴心的服务。

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