【求助】聚丙烯酰胺凝胶灌胶为什么总是不凝固？ |
您所在的位置：网站首页 › wb分离胶不凝的原因 › 【求助】聚丙烯酰胺凝胶灌胶为什么总是不凝固？ |
|
我配制的是6％非变性聚丙烯酰胺凝胶，跑DNA用的用琼脂糖封边后灌胶，靠近梳子的一段总是不凝固，放了一夜，第二天早上一看，还是没凝固，下面的都凝了。不知道是什么原因，有什么解决办法，谢谢！过硫酸铵有问题过硫酸铵是新配的啊而且胶一大部分都凝固了，就是上面的梳子周围的一小部分没有凝固如果是过硫酸铵的问题，应该都不凝吧我也碰到这个问题,解决不了,期待有经验的师兄师姐给解决一下!!可能的原因:1: 5xTAE是否放置过久或PH值不太对,建议新配制; 30%的PAGE检查是否有问题,如果他们配比不对的话可能会导致凝聚不好2: 过硫酸铵建议使用别超过一个周,一周内4度保存没什么问题3: 凝不了的话建议加大TEMED的量,在原来基础上再增加一倍的体积我觉得应该就能凝了,对实验影响不大祝你好运!拿新鲜的过硫酸氨，TEMED，试试！灌胶之前一定要混匀！谢谢各位大侠我今天中午又做了一块胶，多加了些过硫酸胺，下午拔梳子的时候上面还是有部分没有凝固，不过有一半高度的梳齿，可以点样。我用的是120V的电压，各位都用多大的电压，一般跑多少个小时？ 跑完要银染，银染方案有很多种，不知大家用都是哪种方案？ 我们实验室最近也有这样的情况，后来发现灌好胶后，放在37度培养箱中会很快凝固，你可以试试。关于银染，我用的方法，效果还不错：固定：10%乙醇20min。清洗：双蒸水冲洗凝胶2次，每次3min。染色：染色液（0.15%硝酸银，120uL37%甲醛，100mL双蒸水。现配）染色30min。清洗：迅速洗凝胶1次。显影：3g碳酸钠，0.15mL37%甲醛，20uL 10mg/mL硫代硫酸钠。显影至带纹出现。条带出现后马上就倒掉显色液，否则会染得像海带。如果染深了，可以加些冰乙酸，即醋酸，可以帮助终止脱水：10%乙醇10min具体的，你做几次，摸索一下就清楚了，不是很难，染出来后照出的像很好看。用塑料袋密封可以保存很长时间。 nemo1016 wrote:我配制的是6％非变性聚丙烯酰胺凝胶，跑DNA用的用琼脂糖封边后灌胶，靠近梳子的一段总是不凝固，放了一夜，第二天早上一看，还是没凝固，下面的都凝了。不知道是什么原因，有什么解决办法，谢谢！1。首先要确定你的AP是否过期，我们实验室一般室温放置2周（夏天除外），4度放置1个月都可以。 2。凝胶时室温的影响：根据经验室温低时，可以把胶凝的时间延长一点，30分钟以上，以充分凝固，这样就可以防止个别梳子，特别是俩端的梳子不凝固，室温高时，也不要时间过长，梳口有碎胶不好处理。 3。加快凝胶方案：可以加大AP和TEMED的量，或放置在烘箱里（30度左右为好） 银染方案： 银染 10%乙醇固定10min→1%硝酸还原10min→10%冰醋酸终止反应→50%乙醇脱水，干燥保存，将凝胶放置在两层透气性良好的玻璃纸之间，压平，4℃冰箱干燥，可永久保存(以上各步骤之间用蒸馏水冲洗3次，每次30s.（另外，胶在固定过程中，应均匀浸泡） 就只有梳齿周围没凝固显然不是AP的问题，请问你是怎样配制和混合浓缩胶的？如果放置时间过长，和在空气中暴露或混合时间过长都会使凝胶明显收缩，所以配胶和混胶的时候注意一下试试看。除了以上各位提到的加大AP和TEMED的量，放置在烘箱里，（30度左右为好）必须混均匀等方法外可以参考以下几点：1.首先要确定你配制的AP及固体AP是否过期，检测方法是在配制加入水是迅速放在耳边听，如能听到噼里啪啦的响声，说明你的AP正常。2.凝胶温度也影响：因为聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶过程不同，前者为化学聚合而后者为物理聚合，故前者聚合时需要能量，因此在40～50度下凝胶可以加速聚合，加快凝胶过程。凝胶时可以在电极槽中加入50度的水加速聚合。3.在加入AP之前把混好的液体抽真空，以除去里面的氧，氧对聚合有影响，液体中大量的氧存在也影响聚合速度及胶的均匀度。4。有时不同厂家生产的Bis,Arc,甚至同一厂家不同批次的Bis,Arc,凝固过程也不同，我曾经遇到过。有的凝胶储液一配下就可以制胶，有的则必须在4度放置4～7天后才可以用，而且很好用，凝胶速度变得快多了。 |
今日新闻 |
推荐新闻 |
| CopyRight 2018-2019 办公设备维修网 版权所有 豫ICP备15022753号-3 |