免疫沉淀实验（IP，immunoprecipitation）结合免疫印迹（WB，Western Blot），是目前研究和验证蛋白质-蛋白质相互作用的一种重要实验方法。本文将介绍IP-WB的实验流程并为大家解析常见的理想结果和异常结果。

1.IP-WB的实验过程

经典的IP-WB实验通常包括以下主要步骤：首先以较温和的裂解液从细胞或组织中提取得到蛋白溶液，然后加入抗体和微珠进行孵育，再通过离心或磁力架去除上清游离蛋白，就可以获得微珠-抗体-诱饵蛋白-互作蛋白的复合物。将微珠上的蛋白洗脱下来之后，通过SDS-PAGE将复合物中的各种蛋白成分根据分子量进行分离，并转移到膜上，再依次以一抗和二抗孵育转印膜，最后通过二抗的显影将靶标蛋白的检测信号在WB结果中显印出来。

具体实验步骤可以分为：

①细胞裂解、②抗体孵育、③清洗、④洗脱、⑤电泳、⑥转膜、⑦封闭、⑧一抗孵育、⑨二抗孵育、⑩显影等。其中步骤②IP实验中孵育的抗体与步骤⑧WB实验中使用的一抗是影响IP-WB结果的重要因素。前者针对IP实验的诱饵蛋白，后者可以针对诱饵蛋白，也可以针对诱饵蛋白的某一个互作蛋白。当需要评估IP实验是否成功纯化或富集到选定的诱饵蛋白时，步骤⑧使用的一抗为针对诱饵蛋白的抗体；当需要验证诱饵蛋白与互作蛋白间的相互作用时，步骤⑧使用的一抗则是针对这个需要验证的互作蛋白。而前者的成功往往是后者实验的前提。

以下主要分析在评估IP实验时，IP抗体与WB一抗同时针对诱饵蛋白时的结果。

2.理想IP-WB结果分析

通常IP-WB实验会以input（全细胞裂解液）作为阳性对照样品，以空白IP作为阴性对照样品，因此完整的IP-WB结果至少需包含3个泳道的WB显影结果（下图黑色实线框区域，泳道1-input，泳道2-IP，泳道3-IgG/control）。如果为了能够更全面详细的评估IP的实验结果，还可以将IP实验抗体孵育后的上清液也作为阴性对照进行WB检测（泳道4-IP-Flowthrough；泳道5-IgG/control-Flowthrough）。

理想的IP-WB实验通常会显现出如下图所示的结果：

泳道1-input，通常采用IP孵育前的全细胞裂解液，若该泳道中能显现出诱饵蛋白的条带，且无其他非特异性条带，证明诱饵蛋白正常表达且能够被所用的抗体识别，并且抗体显影的特异性较高。若input泳道采用IP孵育后、清洗和洗脱前的细胞裂解液-beads-抗体混合悬液，则该泳道中也会显现出抗体轻重链的条带。

泳道2-IP，即实验组细胞裂解液经抗体孵育、清洗、洗脱后的蛋白样品，若该泳道中能显现出较强的诱饵蛋白的条带，且无其他非特异性条带，说明诱饵蛋白被IP所用抗体成功富集纯化，并且抗体富集纯化的特异性较高。同时通常会在约55kD和25kD左右可能分别显现出来源于抗体重链和轻链的非特异性条带。

泳道3-IgG/control，即空白对照组细胞裂解液经抗体孵育、清洗、洗脱后的蛋白样品，该泳道中不显现出诱饵蛋白条带。

泳道4-IP-Flowthrough，即实验组抗体孵育后的上清液，该泳道中可能显现出较浅的诱饵蛋白条带，反映的是细胞裂解液中未被IP孵育抗体充分富集纯化的诱饵蛋白。

泳道5-IgG/control-Flowthrough，即对照组抗体孵育后的上清液。若对照组采用与泳道1相同的细胞使用空白IgG进行IP实验，则该泳道会显示出与input泳道近似的诱饵蛋白条带；若对照组采用表达空白标签的细胞以实验组相同的标签抗体进行IP实验，则该泳道不会显示出诱饵蛋白条带。

在正式的文章结果中，往往仅需要提供下图中红色实线区域内的结果。但若要更准确的评估IP的实验效果，找到可能存在的实验问题，则需要提供尽量详细完整的实验结果以及泳道、条带和Marker标注。

3.IP-WB结果的常见问题

§ 3.1 对照组泳道出现诱饵蛋白条带

在IP-WB的实验结果中，如果诱饵蛋白同时在实验组和对照组中的相同位置显色（如上图左所示），通常可能有2种原因：

1. 诱饵蛋白分子量与抗体重链或轻链相近，因此无法区分开，显现出的条带并不仅仅是诱饵蛋白，而是抗体重链或轻链；

2. 对照组设计或操作不当，导致不同样品或相邻泳道间出现交叉污染。

前者可通过在步骤⑧使用与步骤②IP孵育不同种属的一抗进行WB、或使用仅抗轻链、仅抗重链或仅抗完整抗体的二抗来排除IP抗体轻重链的干扰。后者则需要排查实验设计和步骤并进行重复实验。

§ 3.2 input泳道无诱饵蛋白条带或条带过多

input泳道中无诱饵蛋白，其IP-WB结果通常如示意图显示，在input组中诱饵蛋白没有显色，在IP组和Control组中只有抗体的重链和轻链。这种结果通常有2种原因：

1. 诱饵蛋白的表达量过低或未能成功表达。可更换细胞系或排查标签诱饵蛋白的表达情况。各细胞系中内源性蛋白的表达量可以参考Proteomic DB或Human Protein Atlas等数据库中的信息。

2. IP抗体亲和纯化能力过低或WB抗体无法成功识别诱饵蛋白。建议更换抗体进行测试，可参考已验证的抗体数据库（https://www.labome.com/index.html）。

如果input中显现出的条带过多，则表明IP抗体的特异性较差，会引入假阳性的结果。非诱饵蛋白条带的其他非特异性条带越多，则假阳性结果越多。通常建议更换特异性更好的抗体进行IP实验。

§ 3.3 IP泳道诱饵蛋白条带过浅

通常来说经过IP亲和纯化/富集后，诱饵蛋白浓度会上升。因此在理想的IP-WB结果中，IP泳道中诱饵蛋白条带应比input泳道中诱饵蛋白条带显色更深。       

如果在IP组中诱饵蛋白的条带比input泳道浅（图左），则表明，IP过程中诱饵蛋白的富集效果较差，通常可能是由于实验操作不当、IP抗体等材料用量不足，或IP抗体亲和效价不高。

如果抗体轻重链条带显色很深，表明IP抗体用量充足，而诱饵蛋白条带显色还是比input泳道的条带浅（图右），通常建议更换效价更好的抗体。

§ 3.4 对照组泳道与IP组泳道差异过大

抗体轻重链条带深浅可用于评估IP抗体的用量。理论上实验组和对照组应使用相同用量的抗体，但若实验设计中使用同种属空白对照IgG作为对照，由于抗体浓度的差异可能难以保证用量完全一致。若实验组与对照组泳道差异过大，则可能表明实验组与对照组的具体设置可能存在问题，需要调整抗体用量、抗体类型或其他实验参数。

4.总结

在IP-WB的结果图中，通常可重点关注以下3方面结果：

1. Input泳道中的蛋白条带，可用于判断IP抗体特异性，并确定诱饵蛋白条带位置；

2. IP泳道和IgG/control泳道中诱饵蛋白条带的差异，用于判断经过IP实验，诱饵蛋白是否得以成功纯化富集；

3. 实验组input，output，flowthrough泳道诱饵蛋白条带差异，可用于判断IP实验中诱饵蛋白的纯化富集效率。

请注意，本文所介绍的IP-WB是指IP实验后针对诱饵蛋白的WB实验，通常可作为IP-MS的预实验，用于评估IP实验是否成功。

需要注意的是，虽然WB实验中经常根据条带深浅对蛋白进行相对定量，但WB显色的定量性能相当有限，定量线性范围和准确性都并不十分理想。即使是相同的样品和步骤，通过调整WB的显色试剂用量和曝光时间等参数，都可能对条带的相对深浅造成很大影响。WB显色条带的深浅也无法用于判断对应蛋白的绝对定量信息，即WB显色深并不一定表明该蛋白含量一定较多。

同时，也由于WB和质谱检测性能、原理等各方面的差异，IP-WB实验结果并不能完全指示IP-MS实验结果。IP-WB实验成功并不能完全保证能获得理想的IP-MS实验结果，IP-WB结果不理想，也有可能通过IP-MS获得较好的实验结果。