背景技术：

2.维生素d(以下称vd)是一种脂溶性类固醇衍生物，是人体必需的维生素，主要包括vd2和vd3两种形式。人体内的vd可以通过阳光照射转化或从食物中摄取，例如贮存于皮下的7-脱氢胆固醇经阳光中紫外线照射后可转化为vd3，而vd2可以通过食物进行补充。人体内的vd2和vd3经肝脏会代谢为25-oh vd2和25-oh vd3，血液中25-oh vd2和25-oh vd3浓度高，是体内vd的主要存在形式，且稳定好，体内循环半衰期约为2-3周，因此血液中的25-oh vd2和25-oh vd3成为公认的评价人体vd营养状态的最可靠指标。3.然而，在人体中还存在25-oh vd3的差向异构体——3-epi 25-oh vd3，约占总25-oh vd的4％，其在成人体内含量较低，但在新生儿体内浓度极高，约占25-oh vd总浓度的60％。3-epi 25-oh vd3不具有生物活性，在检测时若不能有效分离该物质，将造成25-oh vd3的检测结果偏高的误差。4.传统的维生素d检测方法有放射免疫法、竞争蛋白结合法、高效液相色谱法等，其中放射免疫法、竞争蛋白结合法存在前处理复杂、分析时间长、通量低、方法特异性差的缺点，且不能同时准确定量25-oh vd2和25-oh vd3的含量。目前国际普遍认为lc-ms/ms是检测血清中25羟基维生素d的“金标准”，然而当前所用方法仍未能对差向异构体进行有效的分离，检测结果存在偏差。5.因此，本发明希望建立一种操作简便、特异性高、灵敏度好的用于检测人血清中25羟基维生素d的方法。

技术实现要素：

6.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种血清中25羟基维生素d的检测方法，该检测方法特异性强、准确度高，适用于各年龄段人群血清样本中25羟基维生素d的检测。7.本发明提供了一种血清中25羟基维生素d的检测方法，采用液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)进行检测，所述液相色谱的条件包括：色谱柱为uplc acquitytm hss pfp column；流动相a为0.1％-0.5％甲酸水溶液，流动相b为甲醇。8.本发明提出，以上述流动相体系结合特定的色谱柱类型，可以实现25-oh vd2、25-oh vd3和3-epi 25-oh vd3的有效分离，从而提高血清中25羟基维生素d的检测准确性。9.优选地，所述色谱柱的尺寸为2.1mm×50mm,1.8μm。10.优选地，所述液相色谱采用梯度洗脱的方式。11.更优选地，所述梯度洗脱的条件为：12.0-4min，流动相b的体积分数由70％变化至95％；13.4-4.01min，流动相b的体积分数由95％变化至70％；14.4.01-4.5min，流动相b的体积分数为70％。15.优选地，所述液相色谱的条件还包括：流速为0.4ml/min；柱温为40℃；进样量为2-10μl。16.优选地，所述质谱的条件包括：esi源正离子模式，多反应监测扫描模式；喷雾电压：1.5-2.5kv；去溶剂温度：450-550℃；雾化器流速800-1000l/h；离子源温度：120-150℃；锥孔气流速：55-65l/hr。17.优选地，所述质谱的检测参数如下所示：18.目标分析物q1(da)q3(da)cv(v)ce(v)25-oh vd2413.3113.1201025-oh vd3383.3257.2201525-oh vd2_is416.4113.1201025-oh vd3_is386.3257.2201519.优选地，所述检测方法还包括：20.以bsa为基质，配制含不同浓度梯度目标物的校准品溶液，加入同位素标记物进行预处理后，用lc-ms/ms检测；以校准品溶液中目标物的浓度为x轴，以校准品溶液中目标物与其对应同位素标记物的峰面积比为y轴，绘制得到标准工作曲线；21.在待测血清样本中加入同位素标记物，进行预处理后用lc-ms/ms检测，并根据标准工作曲线得出待测血清样本中25羟基维生素d的含量。22.相对于现有技术，本发明的有益效果如下：23.(1)本发明所提出的检测方法特异性强、准确度高，可实现25-oh vd3与其差向异构体3-epi 25-oh vd3的分离，适用于各年龄段人群血清样本中25羟基维生素d的检测；24.(2)本发明所提出的检测方法操作简单，可操作性强，分析时间短，可实现高通量检测。附图说明25.图1为实施例2中儿童血清样品的检测结果；26.图2为实施例3中对照组1的检测结果；27.图3为实施例3中对照组2的检测结果；28.图4为实施例3中实验组的检测结果。具体实施方式29.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例仅为本发明的优选实施例，对本发明要求的保护范围不构成限制作用，任何未违背本发明的精神实质和原理下所做出的修改、替代、组合，均包含在本发明的保护范围内。30.以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。31.实施例132.本实施例提供一种血清中25羟基维生素d的检测方法，采用液相色谱串联质谱oh vd3与其差向异构体3-epi 25-oh vd3的分离情况。56.对照组1：beh c18(2.1mm×50mm,1.7μm,waters)；57.对照组2：beh phenyl column(2.1mm×50mm,1.7μm,waters)；58.实验组：hss pfp column(2.1mm×50mm,1.8μm,waters)；59.图2-4的结果显示，对照组1和对照组2中25-oh vd3与其差向异构体3-epi 25-oh vd3的出峰时间一致，无法实现25-oh vd3与其差向异构体3-epi 25-oh vd3的分离；而实验组可达到良好的分离效果。以上结果表明色谱柱的种类对于25-oh vd3与其差向异构体3-epi 25-oh vd3的分离起到重要作用，只有特定的色谱柱类型与实施例1中的流动相结合才能起到良好的分离效果。60.实施例4：检测方法的性能评价61.1.线性回归方程及线性相关系数62.采用实施例1中所述方法建立工作曲线，结果见表2，目标分析物标准曲线的线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量需求。63.表2线性回归方程及线性相关系数[0064][0065]2.定量美国nist-srm972a准确度评价[0066]采用实施例1的检测方法对srm972a(美国nist)冷冻人血清进行定量检测，并与靶值进行比较，表3的结果显示level3中的25-oh vd2和25-oh vd3准确度分别为100.83％、93.38％；level4中25-oh vd3准确度为93.03％(level4中含26.0ng/ml的3-epi 25-oh vd3，若无法分离，会导致定量结果偏高)，该结果表明采用实施例1的方法准确度高。[0067]表3nist样本的定量结果[0068][0069]3.定量正常人血清样本准确度评价[0070]采用实施例1的检测方法对正常人血清低、中、高三个水平的加标回收率进行评价，表4的结果显示加标回收率在89.22％-96.39％之间，能够满足定量要求。[0071]表4正常人血清加标回收率[0072][0073]4.精密度考察[0074]取正常人血清进行低、中、高三个浓度的加标，每组样6个平行，连续处理三天，计算日内精密度和日间精密度，结果见表5。[0075]表5日内日间精密度[0076][0077]由上述性能验证结果可知，实施例1所提出的方法准确度和精密度良好，特异性强，适用于各年龄段人群血清样本中25羟基维生素d的检测。[0078]上面结合附图对本技术实施例作了详细说明，但是本技术不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本技术宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。